轉(zhuǎn)錄因子POU5F1在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究及膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞免疫逃逸的初步探討.pdf

1、肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，因肺癌死亡的患者占惡性腫瘤死亡的19％，到2025年我國每年肺癌患者將超過100萬，成為世界第一肺癌大國。肺癌目前主要采取以手術(shù)切除后進(jìn)行放化療的綜合治療，但效果并不理想。
　　究其原因，一方面是由于肺癌的發(fā)病率和轉(zhuǎn)移率較高，肺癌患者的5年生存率不足15％。導(dǎo)致大部分患者死亡的因素不是因為腫瘤復(fù)發(fā)，而是發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在某些早期肺癌(T1N0M0)中，一經(jīng)診斷就發(fā)現(xiàn)

2、已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或者存在亞臨床轉(zhuǎn)移。對此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)沒有特別有效的治療方法。另一方面，在包括肺癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在一群數(shù)量微小、具有自我更新和多向分化的潛能的特殊細(xì)胞亞群——腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells，CSCs)[2]。該群細(xì)胞的侵襲能力、成瘤能力均較普通腫瘤細(xì)胞強(qiáng)[3]，且可耐受放化療[4]，從而導(dǎo)致常規(guī)的治療策略失效。已有大量的實驗證實，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤從發(fā)生到演進(jìn)，直至預(yù)后的一系列進(jìn)程如:腫瘤發(fā)生、血管生

3、成[5]、免疫抑制[6]、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中扮演著重要作用。深入研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，對于解釋腫瘤形成過程中患者的臨床表現(xiàn)及闡明其發(fā)生的機(jī)制具有重要意義，并為下一步新的靶向治療提供依據(jù)。
　　對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行深入研究，首先要做的就是正確識別腫瘤干細(xì)胞。現(xiàn)階段判斷某群細(xì)胞是否是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記、具有自我更新和多向分化潛能以及在動物體內(nèi)連續(xù)的成瘤能力。其中爭議最大的是干細(xì)胞標(biāo)記，因為腫瘤類型的不同而有所差異[1][

4、2]。盡管如此，維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的轉(zhuǎn)錄因子POU5F1和Sox2等作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記已經(jīng)被大家廣泛接受[3][4][5]。
　　起初關(guān)于POU5F1和Sox2轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在胚胎干細(xì)胞中，后來逐漸擴(kuò)展到腫瘤研究中[6]。自從提出腫瘤干細(xì)胞的概念之后，POU5F1在腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮的作用也就順理成章的成了研究人員關(guān)注的焦點[7]。為了研究POU轉(zhuǎn)錄因子家族成員POU5F1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，我們以

5、肺癌作為研究模型，首先從A549細(xì)胞中分離并鑒定了肺癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(LungAdenocarcinomaCancerStem-likeCells，LACSLCs)，并比較了LACSLCs與普通腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力;其次，我們用慢病毒干擾的方法下調(diào)LACSLCs中POU5F1的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;然后，我們檢測POU5F1表達(dá)下調(diào)之后，觀察經(jīng)典的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrixmetallop

6、roteinases2，MMP2)的表達(dá)變化，以及二者之間的調(diào)控關(guān)系;最后，我們研究了POU5F1、MMP2與預(yù)后之間的關(guān)系，揭示其可作為預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志。
　　腫瘤細(xì)胞主要通過血管或淋巴道發(fā)生轉(zhuǎn)移。其要發(fā)生轉(zhuǎn)移，很關(guān)鍵的一步就是腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中避免被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別和殺傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機(jī)制分為兩方面:1、腫瘤細(xì)胞自身的免疫逃逸機(jī)制，如細(xì)胞表面“抗原覆蓋”或被封閉[8]、抗原和免疫應(yīng)答分子表達(dá)

7、下調(diào)或缺失[9]、表達(dá)抑制性共刺激分子[10]以及細(xì)胞死亡信號通路缺陷等;2、抑制免疫系統(tǒng)功能，如減少免疫細(xì)胞浸潤、抑制免疫細(xì)胞功能[11]、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)等。
　　而腫瘤干細(xì)胞免疫學(xué)方面的研究，還在起步階段。樹突狀細(xì)胞(DendriticCells，DCs)作為具有最強(qiáng)抗原提呈能力的專職抗原提呈細(xì)胞，與腫瘤干細(xì)胞相互作用的研究還未見報道。因此，我們的另一部分研究選用

8、成人最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤——惡性膠質(zhì)瘤作為研究模型，分別從小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和人膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞中分離和鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Gliomastemcells，GSCs);其次，培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞系DC2.4并分離人樹突狀細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定;第三，分別使用GSCs/和貼壁生長腫瘤細(xì)胞(Adheredcells，ACs)上清液誘導(dǎo)DCs分化，觀察前者對后者分化的影響;最后，我們研究了GSCs/ACs抑制DCs

9、分化的可能機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果:
　　1.成球生長A549細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。
　　半量換液成球培養(yǎng)得到的腫瘤細(xì)胞球可作為LACSLCs進(jìn)行后續(xù)的實驗:與普通細(xì)胞相比，成球生長的A549細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CD133、ALDH1、Sox2、POU5F1以及低表達(dá)分化標(biāo)志物CK8和CK18;成球細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)成球;成球細(xì)胞相比貼壁細(xì)胞具有更強(qiáng)的成瘤能力。僅1×104個成球細(xì)胞

10、即可在對應(yīng)的動物模型中成瘤，然而貼壁細(xì)胞需要5×105個才能成瘤。
　　不論是在平板劃痕實驗還是在鋪有Matrigel的Transwell小室實驗中，都證實成球細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，并且成球細(xì)胞形成的小鼠皮下移植瘤中可見到明顯的侵襲性生長。
　　2.高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子POU5F1的LACSLCs同樣高表達(dá)MMP2。
　　通過激光共聚焦和Westernblotting的方法證實，在高表達(dá)POU5F1的LACSLCs中

11、，同樣高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP2。
　　3.POU5F1直接調(diào)控MMP2的轉(zhuǎn)錄。
　　(1)應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)，下調(diào)POU5F1的表達(dá);
　　(2)下調(diào)POU5F1表達(dá)后，LACSLCs平板遷移能力和Transwell侵襲能力均明顯減弱(p＜0.01）;
　　(3)干擾POU5F1表達(dá)后，成球細(xì)胞的成瘤能力顯著下降;
　　(4)干擾POU5F1表達(dá)后，MMP2的表達(dá)隨之下降;
　　(5

12、)通過免疫共沉淀和熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實POU5F1可直接結(jié)合MMP2的啟動子區(qū)域，干擾POU5F1表達(dá)后，包含有MMP2啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)的活性明顯下降。
　　4.POU5F1和MMP2可以作為評估肺癌預(yù)后的指標(biāo)。
　　在55例肺腺癌組織芯片標(biāo)本中，高表達(dá)POU5F1和MMP2的病例數(shù)分別是26例(47.3％)和39例(70.9％)，二者聯(lián)合檢測與患者的預(yù)后密切相關(guān)(P＜0.01）。
　　5.收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞的

13、培養(yǎng)上清液，干預(yù)處于誘導(dǎo)分化階段的樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（細(xì)胞系和原代培養(yǎng)細(xì)胞）可通過分泌細(xì)胞因子的方式抑制DC成熟;
　　綜上所述，本研究的主要結(jié)論是:
　　1.人LACSLCs中POU5F1高表達(dá)與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其通過直接調(diào)控MMP2增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長和播散。
　　2.對肺癌患者進(jìn)行POU5F1和MMP2聯(lián)合檢測，可作為患者預(yù)后的依據(jù)。
　　3.膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可能通過高