利用穩(wěn)定敲低細(xì)胞模型研究PLCγ1和PKCα在膠質(zhì)瘤侵襲中的機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，占顱內(nèi)腫瘤的40％～50％，治療方法以手術(shù)加放化療為主，但因其早期即呈侵潤(rùn)性生長(zhǎng)，故預(yù)后不盡理想，惡性膠質(zhì)瘤如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者大多(77％)在確診后1年內(nèi)死亡。腫瘤的生長(zhǎng)需要依靠血管系統(tǒng)來攝取營(yíng)養(yǎng)和代謝廢物，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移首先表現(xiàn)在新生血管的形成，這個(gè)過程包括周圍基質(zhì)的降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖以及管型的形成，生長(zhǎng)因子在這一過程中發(fā)揮重要作用，他們通過直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管

2、發(fā)生需要的關(guān)鍵酶或調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)的表達(dá)而發(fā)揮作用。表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)通過參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞侵襲能力，Joshua等研究證明接受表皮生長(zhǎng)因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)刺激后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間Ca2+濃度([Ca2+]i)增加

3、并可持續(xù)10min，前一作用可被磷脂酶C-γ1(PhospholipaseCgammal，PLCγ1)特異性抑制劑U-73122拮抗，說明神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的增加依賴PLCγ1信號(hào)通路，而細(xì)胞[C2+]i的波動(dòng)與細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)聯(lián)，細(xì)胞遷移和增殖與腫瘤侵潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，這些間接說明PLCγ1信號(hào)通路可以影響腫瘤侵潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 PLCγ1受生長(zhǎng)因子-受體復(fù)合物刺激發(fā)生酪氨酸磷酸化激活后，作為一種信號(hào)分子，在細(xì)胞生

4、長(zhǎng)與分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在多種腫瘤中均有PLCγ1的高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展程度有關(guān)。研究表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PLCγ1可介導(dǎo)生長(zhǎng)因子引發(fā)的腫瘤侵潤(rùn)信號(hào)通路，作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中一個(gè)重要的分子開關(guān)，PLCγ1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式還不十分清楚。 PLCγ1激活后水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosp-hate，PIP2)產(chǎn)生

5、兩種第二信使：肌醇1，4,5-三磷酸(inositol1，4,5-triphosphate，IP3)和甘油二酯(diacylglycerol，DAG)，誘導(dǎo)鈣離子釋放，繼而激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)，從而起始下游一系列信號(hào)反應(yīng)。PKC家族包含3大類，至少12種亞型，各種亞型在不同腫瘤組織及腫瘤的不同階段中的表達(dá)各不相同。其中，在多種腫瘤的發(fā)展及惡性表型維持中PKCa／β起重要作用。有研究顯示PKCa在膠質(zhì)瘤細(xì)

6、胞中高表達(dá)，并介導(dǎo)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲，但其具體機(jī)制不明。 在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，核因子-κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)以無活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，并與NF-κB抑制劑IκB家族結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到NF-κB激活劑刺激時(shí)，與IκB家族分離，從細(xì)胞質(zhì)易位至細(xì)胞核，與κB基序相結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。很多研究證實(shí)，不僅在免疫及炎癥反應(yīng)中，NF-κB在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中亦發(fā)揮重要作用，NF-κB可以激活多種轉(zhuǎn)

7、錄因子，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)促進(jìn)和維持腫瘤惡性表型起重要作用?？傊?，NF-κB通過誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)凋亡，促進(jìn)血管生成，對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但迄今為止，腫瘤細(xì)胞中NF-κB的激活機(jī)制仍未闡明。 我們以前的研究曾揭示，PLCγ1通過NF-κB介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系Lovo的運(yùn)動(dòng)和遷移。許多研究均發(fā)現(xiàn)，PKC家族中在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)產(chǎn)生的NF-κB激活過程中起到關(guān)鍵作用。在B淋巴細(xì)胞中，BCR可通過PLCγ2-P

8、KC-CARMA1-NF-κB級(jí)聯(lián)介導(dǎo)其增殖和存活；而在內(nèi)皮細(xì)胞中，TRAFs-PLC-PI3K-PKC(PKCα和PKCζ)-ROS-NF-κB這一級(jí)聯(lián)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。這些研究成果揭示了PLC、PKC和NF-κB之間可能存在的相互作用。 本研究以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-87MG為模型，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)及RNA干擾技術(shù)，研究了PLCγ1，PKCα和NF-κB在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的關(guān)系，以期揭示人神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制并尋找相

9、關(guān)信號(hào)通路中心調(diào)節(jié)物，為靶點(diǎn)新藥物研發(fā)提供細(xì)胞與分子生物學(xué)依據(jù)。 首先合成DNA分子(可轉(zhuǎn)錄出具有干擾作用的shRNA)，隨后退火DNA分子成雙連并將其連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER.retro，然后，利用脂質(zhì)體將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染至U-87MG內(nèi)，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低PLCγ1和PKCα的細(xì)胞系。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(WesternBlot)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞中PLCγ1和PKCα的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，運(yùn)用凝膠電泳遷移率改變分析(El

10、ectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)揭示了PLCγ1、PKCα和NF-κB在神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.成功構(gòu)建了人源PLCγ1siRNA和PKCαsiRNA真核表達(dá)的重組載體，所構(gòu)建的載體雙酶切鑒定和DNA序列測(cè)定證明是正確的。然后重組體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U-87MG細(xì)胞并以嘌呤霉素篩選出了穩(wěn)定表達(dá)PLCγ1siRNA或PKCαsiRNA細(xì)胞系，分別命

11、名：U-87／pSUPER.retro／PLCγ1-shRNA-construct(簡(jiǎn)稱U-87PLCγ1-)和U-87／pSUPER.retro／PKCα-shRNA-construct(簡(jiǎn)稱U-87PKCα),經(jīng)WesternBlot分析顯示，與正常的U-87MG細(xì)胞和經(jīng)pSUPER.retro空載體轉(zhuǎn)染的U-87MG細(xì)胞相比，重組載體pSUPER.retro／PLCγ1-shRNA-construct和pSUPER.retro／P

12、KCα-shRNA-construct在蛋白水平上顯著地抑制了PLCγ1和PKCα的表達(dá)。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人源PLCγ1siRNA和PKCαsiRNA真核表達(dá)的重組載體，篩選出了穩(wěn)定敲低PLCγ1和PKCα表達(dá)的細(xì)胞系，從而為進(jìn)一步研究PLCγ1及PKCα在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。 2.人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG高表達(dá)PKCα。本實(shí)驗(yàn)采用WesternBlot，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞為陽

13、性對(duì)照，驗(yàn)證了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG細(xì)胞內(nèi)PKCα的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PKCα在U-87MG細(xì)胞高表達(dá)。 3.在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG中EGF引發(fā)NF-κB核轉(zhuǎn)位的增加可能由PLCγ1介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用EMSA分析得到在生理情況下U-87MG細(xì)胞核內(nèi)少量存在NF-κB，受EGF刺激15min后NF-κB核轉(zhuǎn)位開始增加，到60min達(dá)最高峰，該過程在敲低PLCγ1表達(dá)的U-87MG細(xì)胞內(nèi)可被有效逆轉(zhuǎn)，結(jié)果提示：在U-87

14、MG細(xì)胞中EGF引起的NF-κB核轉(zhuǎn)位增加可能部分依賴于PLCγ1的介導(dǎo)。 4.在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87MG中PKCα可能介導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位的增加。本實(shí)驗(yàn)采用EMSA分析得到受PKC特異性激動(dòng)劑(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)刺激15min后NF-κB核轉(zhuǎn)位開始增加，到60min達(dá)最高峰，該過程在敲低PKCα表達(dá)的U-87MG細(xì)胞內(nèi)可被部分逆轉(zhuǎn)，此