大鼠腦梗死后乏氧組織的動態(tài)變化及其相關(guān)的血管機制.pdf

1、背景： 隨著人口的老齡化，腦梗死的發(fā)病率越來越高，其危害性表現(xiàn)為高致死和致殘率。目前最有效的藥物治療方法溶栓治療，由于需具備十分嚴(yán)格的適應(yīng)癥以及潛在的風(fēng)險(如顱內(nèi)出血)而只能在極少數(shù)病人中得到開展。缺血半暗帶是腦梗死治療的主要靶點。然而，如何確定缺血半暗帶以及腦梗塞亞急性是否仍然存在半暗帶，醫(yī)學(xué)上一直難有明確的定論。 乏氧組織顯像是近幾年來應(yīng)用于缺血半暗帶研究的一種新的方法。乏氧組織是指氧濃度介于正常與無氧之間、且功能異

2、常而尚無明顯形態(tài)學(xué)改變的組織，與缺血半暗帶的概念十分接近。經(jīng)典的觀點認(rèn)為缺血半暗帶最多只能存在40h左右，而乏氧方面的實驗研究也基本都是研究缺血24h內(nèi)的乏氧情況。但是，臨床方面的乏氧研究卻發(fā)現(xiàn)乏氧組織有可能在腦梗死發(fā)生后長期存在，而我們在之前的臨床研究中發(fā)現(xiàn)一例患者在發(fā)病44d后，仍然存在乏氧組織。因此乏氧組織是否真的能長期存在，如果能，為何有些患者存在，有些患者沒有？而這些腦梗死后期的乏氧組織究竟以什么機制持續(xù)存在著，是否與血管的增

3、生或分布有關(guān)？ 基于以上的理論和疑問，本實驗擬通過動物實驗探索乏氧組織的存在時間長短是否與再灌注的時間點有關(guān)，并且進(jìn)一步研究腦梗死后期的乏氧組織與血管增生的關(guān)系。 第一章：大鼠腦梗死后乏氧組織的動態(tài)變化 一、目的： 1.分別利用放射自顯影和免疫熒光法探索乏氧組織的持續(xù)時間是否與缺血灌注時間點有關(guān)，并篩選出哪個缺血時間點再灌注的大腦中動脈閉塞(MCAO)模型可以長期存在乏氧組織(≥14d)。 2.研

4、究不同缺血再灌注時間點的MCAO模型其乏氧組織的動態(tài)變化如何。 二、方法： 1、實驗動物： 健康成年雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠120只，清潔級，體重280～330g，人工晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。 2、缺血再灌注模型的制作： 參照Longer氏法，稍加改良。到缺血預(yù)定時間點后，將栓線拉回到頸外動脈的主干中，從而實現(xiàn)再灌注。持續(xù)缺血組不拔線。假手術(shù)組不插線，其余操作同上。 3、實驗分組

5、： 分為持續(xù)缺血組(PI)、1.5h缺血再灌注組(1.5hIR)、2h缺血再灌注組(2hIR)和3h缺血再灌注組(3hIR)，放射自顯影部分每組再分為術(shù)后1d和術(shù)后14d2個亞組；免疫熒光部分每組再分為術(shù)后1d、3d、7d、14d、21d和28d亞組。每個亞組3只大鼠。腦梗死模型制作不成功或者未生存至預(yù)定時間點或者并發(fā)腦出血(包括蛛網(wǎng)膜下腔出血)者均不算入分組例數(shù)內(nèi)。 4、放射自顯影： 每只大鼠以99mTc—HL

6、91185MBq/0.5ml由股靜脈注入。4h后處死動物并迅速開顱取腦、冰凍切片；以接觸法曝光24h，最后顯影、定影處理。結(jié)束后標(biāo)本行HE染色，以定位乏氧組織。 5、EF5給藥及標(biāo)本處理： 即配的EF5溶液以3mg/100g體重的劑量通過尾靜脈注射進(jìn)大鼠體內(nèi)。4h后行心臟灌注、開顱取腦，標(biāo)本先以4％多聚甲醛固定6h，再經(jīng)梯度蔗糖脫水處理，最后行冰凍切片。 6、免疫熒光法乏氧顯像 分常規(guī)染色組和EF5競爭對

7、照染色組：常規(guī)染色組一抗為Cy3標(biāo)記的ELK3-51(75ug/ml)；EF5競爭對照染色組用Cy3-ELK3-51 competed溶液代替Cy3-ELK3-51，用以判斷假陽性?？瞻讓φ战M不加抗體，以PBS代替。 7、HE染色： 染色過程按標(biāo)準(zhǔn)HE染色法(過程略)。 8、TTC染色： 取部分大腦組織行該項染色，以確定腦梗死。取厚約1～2mm厚的冠狀切面的腦組織(不固定)，加入2％TTC溶液約30ml，

8、避光、37℃孵育30min。 9、組織分區(qū)： 為方便統(tǒng)一在熒光顯微鏡下觀察乏氧組織，擬將每張組織切片的缺血側(cè)大腦半球的周圍皮質(zhì)區(qū)分為4個區(qū)，依次分為A、B、C和D區(qū)(圖1)，顯微鏡下均以×200的倍數(shù)對每個區(qū)域進(jìn)行觀察。 10、圖像分析： 利用Image Pro Plus6.0專業(yè)圖形分析軟件對圖像進(jìn)行累積光密度(IOD SUM)和乏氧組織面積(Area SUM)的測量。 11、統(tǒng)計學(xué)分析：

9、 采用SPSS for Windows Ver.11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果用(-X±s)表示，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。 三、結(jié)果： 1、模型成功率和死亡率： 模型成功率(術(shù)后出現(xiàn)癱瘓且開顱排除并發(fā)腦出血—圖2)約為80％。1.5hIR組死亡率最低，3d內(nèi)為10％左右，7d內(nèi)為20％，7d后很少死亡。PI組死亡率最高，14d內(nèi)約為50％。 2、放射自顯影(圖3): 1.5h

10、IR組術(shù)后1d和14d亞組均為乏氧陽性，乏氧組織呈條片狀，位于梗死側(cè)大腦半球的周圍皮質(zhì)區(qū)，其余各組術(shù)后1天和14天均為乏氧陰性。 3、乏氧組織的動態(tài)變化(圖4): 與放射自顯影的結(jié)果相似，1.5hIR組的乏氧組織持續(xù)時間最長，一直持續(xù)至術(shù)后14d。而其余各組的乏氧組織均只持續(xù)至術(shù)后3d。乏氧組織成片狀或條狀，多位于梗死側(cè)大腦半球的外側(cè)周圍皮質(zhì)，以A區(qū)和B區(qū)多見。 各組乏氧組織的面積和平均光密度隨著時間的延長而逐漸

11、縮小和減弱，但1.5hIR和PI組內(nèi)各亞組的平均光密度沒有減弱(P=0.075和P=0.126)。各組1d時的乏氧面積和平均光密度沒有明顯差異(P=0.844和P=0.536)；而3d時3hIR組的乏氧面積和平均光密度最小(P=0.023和P=0.007)，其余組之間卻沒有明顯差異(P=0.662和P=0.153)。 四、結(jié)論： 1、腦梗死后乏氧組織可以長期存在(≥14d)，但與再灌注時間點有關(guān)；1.5hIR組的缺血側(cè)大

12、腦半球周圍皮層長期處于乏氧狀態(tài)。 2、隨著發(fā)病時間的延長，乏氧組織逐漸消失，可能存活下來或死亡。 3、缺血2h或以上與持續(xù)缺血差不多，均可使腦組織乏氧狀態(tài)很快消失(≤3天)。 4、1.5hIR的MCAO模型是研究腦梗死后長期存在的乏氧組織的合適模型。 第二章：大鼠腦梗死后乏氧組織動態(tài)變化的血管機制 一、目的： 1.探索乏氧組織的分布與微血管分布的關(guān)系； 2.研究腦梗死后乏氧組織的動

13、態(tài)變化與微血管增生的關(guān)系。 3.研究腦梗死后乏氧組織的持續(xù)時間與微血管密度(MVD)的關(guān)系。 二、方法： 1、實驗動物： 健康成年雄性SD大鼠33只，體重280～330g，清潔級，人工晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。 2、缺血再灌注模型的制作： 同第一章。 3、實驗分組： 分3組：1.5hIR組、PI組和假手術(shù)組(S組)；1.5hIR組和PI組再分術(shù)后3d、7d、14d三個亞組，每個亞組5只

14、大鼠。5組共3只大鼠。 4、乏氧組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光雙標(biāo)： 對1.5hIR組和PI組進(jìn)行免疫熒光雙染。用序貫法染色。先染血管內(nèi)皮細(xì)胞，先后以一抗(vWF)、二抗孵育后，4％多聚甲醛室溫固定20min；ttPBS和PBS泡洗，再以10％山羊血清室溫封閉1小時，ttPBS和PBS泡；最后Cy3-ELK3-51避光、4度孵育過夜，50％甘油封片。對S組則單染血管內(nèi)皮細(xì)胞。 5、組織分區(qū)： 將乏氧組織常出

15、現(xiàn)的周圍皮層分為A、B和C三個區(qū)(圖7)。 6、圖像分析及MVD計算方法： 利用Adobe Photoshop CS2專業(yè)圖形分析軟件對A組雙標(biāo)的乏氧圖片和血管圖片進(jìn)行重疊(圖層合并)。利用Image Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件對血管圖片進(jìn)行微血管數(shù)目計算。圖片中每個獨立的點狀或條狀或成簇的綠色熒光圖像，記為一個微血管；有明顯厚肌層的血管不予計算。每張圖片的面積記為一個單位面積，則該圖片的微血管數(shù)即代表MVD

16、。將每張切片A、B、C區(qū)的微血管數(shù)目的平均值作為該切片的MVD，而對同一亞組所有切片的MVD進(jìn)行統(tǒng)計平均作為該亞組的MVD。乏氧組織內(nèi)部(或周圍區(qū)域)的MVD計算依照上述方法按所占比較計算獲得。 7、統(tǒng)計學(xué)分析： 采用SPSS for Windows Ver.11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果用(X±s)表示，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。 三、結(jié)果： 1、1.5hIR組各亞組的乏氧組織內(nèi)部MV

17、D均比外周MVD??；隨著時間延長，乏氧組織內(nèi)部和外周MVD均有增高趨勢，但內(nèi)部MVD相鄰時間點之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.140和P=0.072)；而外周MVD3d和7d沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.513)，但14d明顯高于7d(P=0.012)。 2、隨著時間的延長，1.5hIR組和PI組的缺血側(cè)皮層組織的MVD均逐漸增高。 3.1.5hIR組與PI組3d時的皮層MVD沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.719)；而7d和14d時1.