TLR2在腦梗死大鼠腦組織中的動態(tài)表達及OMT腦保護機制的研究.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，病死率和致殘率高。腦梗死后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜，其中過度炎癥免疫反應存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導致炎癥損傷，此已達成共識，因此，減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。然而，抗炎治療在腦梗死的臨床研究中并沒有取得預期效果。尋找炎癥級聯反應上游的始動因素并加以抑制可能為腦梗死的治療帶來新的突破，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的發(fā)現促進了人們對炎癥

2、始動機制的理解，其中TLR2的結構及其參與炎癥反應、調解免疫應答等方面研究的較為清楚。TLR2不僵在病原微生物性炎癥損傷中起重要作用，也在腦梗死、心肌梗死等非病原微生物性炎癥損傷中發(fā)揮關鍵作用，但TLR2在腦組織中的細胞定位一直存在爭議。氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是從豆科槐屬植物苦參（Scphora flavescens Ait）中提取的生物堿，具有四環(huán)喹嗪啶類結構。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及調節(jié)免疫等多方面藥理作

3、用，但其作用機制尚不完全明確，近幾年對于OMT的研究很多，多集中在抗腫瘤及抗心肌梗死等方面，關于OMT在腦梗死中作用的研究較少。
　　 本實驗以線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（middlecerebral artery occlusion，MCAO）模型，應用RT-PCR和免疫組織化學技術測定腦梗死后TLR2的動態(tài)表達規(guī)律；應用激光掃描共聚焦技術研究TLR2在大鼠腦梗死組織中的細胞定位；應用OMT作為干預藥物，研究OMT對腦梗死后

4、腦水腫、腦梗死體積及TLR2表達的影響，旨在探討OMT在腦梗死中的腦保護作用及其作用機制。
　　 方法：采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機分為4組：假手術組、大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）組、大劑量OMT治療組（120mg/kg，HOMT）和小劑量OMT治療組（60 mg/kg，LOMT）。根據不同時間點每組分為6 h、24 h、48 h、72 h

5、四個亞組。應用Longa等的線栓法建立大鼠MCAO模型。將OMT以生理鹽水制成濃度為40mg/ml及80mg/ml兩種試劑，HOMT組、LOMT組、MCAO組分別給予80mg/ml OMT溶液120mg/kg、40mg/ml OMT溶液60mg/kg及生理鹽水1.5ml/kg，各組均為腹腔注射給藥，手術完畢后即刻給藥一次，之后每天給藥一次，直至相應時間點斷頭處死動物。假手術組除不插線栓外其余操作同MCAO組。
　　 應用RT-P

6、CR測定TLR2 mRNA的動態(tài)表達，免疫組織化學檢測腦組織TLR2免疫陽性細胞數，TTC染色測定腦梗死體積，干濕重法檢測腦組織含水量，Confocal技術觀察TLR2的細胞定位。
　　 結果：
　　 1.腦組織含水量測定。
　　 用干濕重法測得的腦組織含水量結果顯示：MCAO組、LOMT組和HOMT組大鼠病變側腦組織含水量均在術后6 h開始升高，48 h達高峰，72 h開始下降。Sham組大鼠腦組織含水量無明顯

7、升高。與MCAO組相比，HOMT組的腦組織含水量在24，48和72 h明顯下降（P<0.01）。LOMT組除48 h腦組織含水量有所下降外（P<0.05），術后其余時間點的腦組織含水量與MCAO組均無統(tǒng)計學差異。
　　 2.腦梗死體積測定。
　　 TTC染色顯示：sham組腦組織均勻紅染無梗死灶，MCAO組可見大面積白色梗死灶，多位于右側基底節(jié)、頂葉和顳葉皮質。腦梗死體積測定顯示：LOMT組腦梗死體積低于MCAO組，但差

8、異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；HOMT組腦梗死體積低于MCAO組及LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　　 3.腦組織TLR2免疫陽性細胞數及mRNA的動態(tài)表達。
　　 腦組織TLR2免疫陽性細胞結果顯示：MCAO組、I+OMT組和HOMT組大鼠病變側TLR2免疫陽性細胞數均高于sham組，差異有統(tǒng)計學意義（各亞組均P<0.05）；MCAO組6 h陽性細胞開始增加，主要位于腦缺血區(qū)皮層，48 h陽性細胞數達

9、高峰，主要位于缺血半暗帶區(qū)皮層，72h開始下降；
　　 腦組織TLR2 mRNA表達結果顯示：MCAO組、LOMT組和HOMT組大鼠病變側TLR2 mRNA表達均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義（各亞組均P<0.05）；與sham組相比，MCAO后6 h TLR2 mRNA表達即明顯增高，至72 h時達高峰。
　　 4.TLR2的細胞定位。
　　 Confocal結果顯示，腦梗死后TLR2陽性細胞較假手術組明顯增多

10、；梗死后6 h，TLR2主要定位于NeuN陽性神經元，幾乎不表達于Iba-1陽性小膠質細胞及GFAP陽性星形膠質細胞；而梗死后72 h，TLR2主要定位于NeuN陽性神經元及Iba-1陽性小膠質細胞，幾乎不表達于GFAP陽性星形膠質細胞。
　　 5.OMT對腦梗死組織TLR2陽性細胞及mRNA的影響。
　　 TLR2陽性細胞：LOMT各亞組TLR2陽性細胞數較MCAO組減少，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<

11、0.05）；各亞組陽性細胞數較MCAO組減少，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HOMT 72h亞組低于LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6 h、24 h、48 h亞組與LOMT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 TLR2 mRNA表達：LOMT 6 h、24 h亞組與MCAO組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），48 h、72 h亞組均低于MCAO組，差異有統(tǒng)計學意義（P<

12、0.05）；HOMT各亞組與MCAO組比較，TLR2 mRNA表達降低，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HOMT 24h、72 h亞組低于LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6 h、48 h亞組與LOMT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　 結論：腦梗死后TLR2表達升高，在6 h時開始上升，48或72 h時達高峰。腦梗死早期，TLR2上調可能與急性缺血性神經元損傷有關；腦梗死晚期