BMSCs聯(lián)合骨髓移植建立嵌合體并誘導(dǎo)免疫耐受形成的機(jī)制研究.pdf

1、研究意義
　　異體器官移植已成為臟器功能衰竭治療中的一種常規(guī)治療方案。在器官移植領(lǐng)域，目前主要使用免疫抑制藥物來(lái)避免、減輕和逆轉(zhuǎn)排斥反應(yīng)，但是使用這些藥物的同時(shí)也帶來(lái)了一系列問(wèn)題，如感染幾率增加、惡性腫瘤發(fā)病率提高、費(fèi)用昂貴等。盡管如此，這些方法仍不能避免慢性移植物功能衰竭，因此，大量研究致力于尋求一種更好的方法建立免疫耐受。經(jīng)骨髓移植建立混合嵌合體被證實(shí)是建立異體移植免疫耐受的理想方法之一。然而，在誘導(dǎo)混合嵌合體的過(guò)程中，受體必

2、須經(jīng)過(guò)輻射、放療及化療等預(yù)處理方案，以提高造血干細(xì)胞移植成活率，這點(diǎn)很大程度上限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。到目前為止，仍沒(méi)有一種切實(shí)可靠、適用于臨床的預(yù)處理方案。
　　BMSC在體外易于培養(yǎng)擴(kuò)增，BMSCs的低免疫原性與免疫調(diào)節(jié)兩方面特性使得它在治療移植排斥方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。目前，人們已經(jīng)利用BMSCs的免疫調(diào)節(jié)特性對(duì)自身免疫性疾病、全身炎癥反應(yīng)綜合癥及GVHD等多種疾病展開治療，并取得良好的效果?；谀壳巴ㄟ^(guò)骨髓移植建立嵌合體尚無(wú)低

3、毒性預(yù)處理方案，本研究擬嘗試用BMSCs對(duì)受體進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行骨髓移植，觀察是否可以成功建立混合嵌合體并形成免疫耐受。基于Th17/Treg細(xì)胞在免疫排斥與耐受中的重要地位，本研究進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究BMSCs對(duì)Th17/Treg細(xì)胞分化的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索。
　　材料與方法
　　1.將供體（Balb/c）小鼠來(lái)源BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)展，通過(guò)尾靜脈向受體輸注，然后將供體骨髓向受體移植，觀察在不使用免疫毒性藥物

4、的情況下是否可以移植成活形成嵌合體；在此基礎(chǔ)上，將供體及第三方（ICR）小鼠來(lái)源皮片向受體移植，觀察其存活情況，分析是否形成免疫耐受；
　　2.體外培養(yǎng)受體CD4+T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，獲取供體脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，二者進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察在異體抗原刺激下初始T細(xì)胞向Th17/Treg細(xì)胞分化情況；進(jìn)一步在該體系中加入BMSCs進(jìn)行混合培養(yǎng)，觀察BMSCs對(duì)Th17/Treg細(xì)胞分化的影響，通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子等進(jìn)行檢測(cè)，初步探討其

5、可能機(jī)制；
　　3.通過(guò)1-D-MT抑制BMSCs細(xì)胞內(nèi)IDO功能，觀察BMSCs對(duì)Th17/Treg細(xì)胞分化的影響，分析IDO在BMSCs干預(yù)Th17/Treg細(xì)胞分化中的作用。
　　結(jié)果
　　1.BMSCs對(duì)受體預(yù)處理后進(jìn)行骨髓移植，受體外周血中可持續(xù)檢測(cè)到供體來(lái)源細(xì)胞，在移植4周后，供體細(xì)胞占外周血總細(xì)胞約20-25％；在該模型上進(jìn)行皮膚移植，發(fā)現(xiàn)供體來(lái)源皮膚可長(zhǎng)期存活，值得關(guān)注的是，供體來(lái)源皮膚的毛發(fā)在移植后可

6、持續(xù)正常生長(zhǎng)，提示未發(fā)生移植物慢性功能喪失。病理切片顯示，供體來(lái)源皮片結(jié)構(gòu)完整，僅有少量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，而第三方來(lái)源皮片則出現(xiàn)表皮脫落，基底層大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)等；通過(guò)取脾細(xì)胞進(jìn)行單項(xiàng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)成功建立嵌合體的小鼠脾細(xì)胞對(duì)于供體抗原具有低反應(yīng)性，而對(duì)第三方抗原反應(yīng)性正常；
　　2.通過(guò)單項(xiàng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異體抗原刺激初始T細(xì)胞，可促使其向Th17/Treg細(xì)胞分化；BMSCs干預(yù)后，反應(yīng)性T細(xì)胞增殖明顯受抑制

7、，同時(shí)Th17細(xì)胞比例減少，而Treg細(xì)胞增多，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BMSCs可降低反應(yīng)體系中IL-1β、IL-2、IL-6及IL-17，同時(shí)提高IL-10、TGFβ1及IDO；
　　3.通過(guò)1-D-MT預(yù)孵育可抑制BMSCs細(xì)胞內(nèi)IDO功能，該BMSCs對(duì)T細(xì)胞增殖及Th17/Treg細(xì)胞分化的影響作用明顯降低，但培養(yǎng)體系內(nèi)介導(dǎo)TGFβ1及IL-6水平與正常BMSCs組比較未見明顯差異。
　　結(jié)論
　　在不使用任何免疫毒