CagA、MACC1、Th17細胞與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關性研究.pdf

1、目的:胃癌發(fā)病因素很多，本課題通過調查胃癌病人血清中抗幽門螺桿菌細胞毒素相關基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A，CagA)抗體的產生情況，檢測胃癌組織中結腸癌轉移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer1，MACC1)的表達，同時分析胃癌患者IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)Th17細胞和相關細胞因子(IL-17A、IL-23、I

2、L-1β、IFN-γ)及其轉錄因子(RORγt、T-bet)的表達水平，探討:胃癌病人血清中抗CagA抗體的產生和分布情況;MACC1與胃癌的關系及臨床病理參數(shù)的相關性;IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細胞及相關細胞因子與胃癌的關系及臨床病理參數(shù)的關系;并初步探討其可能的作用機制。
　　方法:1)所有胃癌患者與健康人群對照組外周血標本或手術標本均來自蘇州大學附屬第二醫(yī)院，所有胃癌患者均記錄性別、年齡及術后臨床病理分期資料;<

3、br>　　2)通過構建幽門螺桿菌CagA蛋白的原核表達載體，獲得CagA蛋白，通過ELISA方法檢測胃癌患者血清中抗CagA抗體的產生情況;
　　3)采用RT-PCR檢測胃癌患者癌組織和癌旁組織中MACC1 mRNA的表達情況，同時利用免疫組化技術分析MACC1在胃癌組織中的表達情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的相關性;
　　4)分離健康人群對照組和胃癌患者外周血單個核細胞(PBMC)(1×106/cells)，應用PMA(50

4、ng/ml)+Ionomycin(1μg/ml)+Monensin(500ng/ml)刺激培養(yǎng)5h，采用多色流式細胞儀(BD FACSVerse flow cytometer)分別檢測IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)細胞頻數(shù);
　　5)采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(QRT-PCR)技術，檢測外周血PBMC中IL-17A+T細胞主要轉錄因子RORγt，IFN-γ+T細胞相關的轉錄因子T-bet及IL-

5、17A+/IFN-γ+T細胞相關細胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ mRNA的表達水平;
　　6)采用液相芯片技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測胃癌患者和健康人群對照組血清IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度;
　　7)采用SPSS19.0軟件對胃癌組織與癌旁組織MACC1 mRNA表達水平，IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細胞的頻數(shù)及其相關細胞因子表達水平、胃癌患者臨床

6、病理分期等資料進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:1)表達制備高純度的CagA融合蛋白，利用間接ELISA法，調查發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中CagA抗體的陽性率高達83.3％，且與患者的年齡、性別和腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等臨床病理分期等無顯著性差異，同時發(fā)現(xiàn)正常健康體檢者的CagA抗體陽性率僅為5％。
　　2)MACC1 mRNA在胃癌組織中陽性率為70％，顯著高于癌旁組織，MACC1 mRNA表達與胃癌浸潤深度、分化程度及有無淋巴結轉移

7、、TNM分期呈正相關，而與年齡、性別、腫瘤大小無關。并且免疫組化實驗結果表明，MACC1蛋白在胃癌組織中高表達，而在癌旁組織中基本不表達。
　　3)與健康人群對照組比較，胃癌患者組外周血中Th17、γδT17細胞在CD3+T細胞中的頻數(shù)顯著升高，Tc17細胞在CD3+T細胞中的頻數(shù)顯著降低，且Th17細胞頻數(shù)與Tc17細胞頻數(shù)呈負相關;IFN-γ+CD3+CD4+Th1細胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細胞及IFN-γ+CD3+

8、γδT細胞在胃癌患者外周血CD3+T細胞中的比例均顯著低于健康體檢組;
　　4)在外周血Th17、Tc17、IFN-γ+CD3+CD4+T、IFN-γ+CD3+CD8+T細胞的比例與腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)、腫瘤的遠處轉移(M0/M1)分別存在顯著差異;Tc17、γδT17、IFN-γ+CD3+CD8+T及IFN-γ+CD3+γδT細胞在TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)中均存在顯著差異;γδT17、IFN-γ+CD3+

9、γδT細胞與腫瘤的淋巴結轉移(N0/N1+N2+N3)存在顯著差異;
　　5)細胞內IL-17A因子在外周血CD3+T細胞中的來源主要為Th17細胞，其次為Tc17細胞，而γδT17細胞所占比例最少;而細胞內IFN-γ+因子在外周血CD3+T細胞中的來源主要為CD8+T細胞，其次為CD4+Th1細胞，而γδT細胞所占比例最少;
　　6)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的濃度顯著高于健康人群對照組，而IFN-γ

10、的濃度顯著低于健康人群對照組;且IL-17A、IL-23、IL-1β及IFN-γ在腫瘤的淋巴結轉移(N0/N1+N2+N3)和TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)中均存在顯著差異;IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度在腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)中分別存在顯著差異;IL-1β濃度在腫瘤的分化程度（高-中分化/低分化）也存在一定的差異;此外在胃癌患者中血清IL-17A的濃度與Th17細胞的頻數(shù)密切相關(r=0.3310，p=0.02

11、31);
　　7)IL-17A+CD3+T細胞轉錄因子的RORγt mRNA在胃癌患者中的表達水平顯著高于健康人群對照組;而IFN-γ+CD3+T細胞的轉錄因子T-bet mRNA表達水平顯著低于健康人群對照組(P＜0.05);
　　結論: 1)我國胃癌患者大多數(shù)與感染CagA陽性的幽門螺桿菌有關，血清中CagA抗體的檢測有望成為胃癌高危因素的參考指標;
　　2) MACC1表達與胃癌的浸潤深度、分化程度及有無淋

12、巴結轉移TNM分期呈正相關，有望成為胃癌診療的一個新指標;
　　3)胃癌患者外周血CD3+T細胞中，Th17和γδT17細胞呈高表達，Tc17細胞呈低表達，且細胞內IL-17A的來源主要為Th17細胞，這些IL-17A+CD3+T細胞與腫瘤的病理特征存在相關性;
　　4)胃癌患者外周血CD3+T細胞中，IFN-γ+CD3+CD4+Th1細胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細胞及IFN-γ+CD3+γδT細胞呈低表達，且細胞內