MACC1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其初步功能分析.pdf

1、背景及目的:
　　骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是骨骼系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,常發(fā)生于兒童和青少年。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)最初在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌樣本中鑒定,并被證實(shí)為轉(zhuǎn)移形成和無(wú)轉(zhuǎn)移生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。許多研究表明其作用機(jī)制可能是與很多腫瘤相關(guān)的信號(hào)途徑交匯作用共同調(diào)控腫瘤的增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討骨肉瘤中

2、MACC1表達(dá)、調(diào)控、分子機(jī)制及其臨床意義。
　　方法:
　　(1)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨肉瘤組織和正常骨組織中MACC1蛋白的表達(dá);采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)不同臨床階段、不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)以及新鮮的骨肉瘤組織中 MACC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,并應(yīng)用Kaplan–Meier存活曲線分析MACC1與骨肉瘤病人預(yù)后的關(guān)系。
　　(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)

3、檢測(cè)人骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63、HOS、SaOS-2和U2OS)以及人成骨細(xì)胞hFOB1.19中MACC1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平;應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-MACC1,并轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞,同時(shí)將MACC1 siRNA和對(duì)照 siRNA也轉(zhuǎn)染骨肉瘤 U2OS細(xì)胞;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)不同處理骨肉瘤細(xì)胞中 MACC1 mRNA和蛋白水平;CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;軟

4、瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的克隆形成能力;Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化;熒光底物(Ac-DEVD-AMC)檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3活性;Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Akt信號(hào)途徑中關(guān)鍵組分p-Akt和總Akt以及其下游靶基因E-cadherin、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。
　　(3)將不同處理的MG-63和U2OS細(xì)胞皮下接種裸鼠,建立骨肉瘤裸鼠移植瘤模型;

5、監(jiān)測(cè)腫瘤大小,匯制腫瘤生長(zhǎng)曲線,稱量腫瘤重量,評(píng)估其對(duì)增殖的影響;Western blotting技術(shù)檢測(cè)不同骨肉瘤裸鼠移植瘤中MACC1蛋白的表達(dá);免疫組織化學(xué)評(píng)估不同骨肉瘤裸鼠移植瘤中Ki-67增殖指數(shù)。
　　結(jié)果:
　　(1)半定量RT-PCR顯示骨肉瘤組織中MACC1 mRNA的平均表達(dá)水平顯著高于正常骨組織(P<0.01),并由實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí);III期臨床的骨肉瘤病人的MACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高

6、于I和II期臨床的骨肉瘤病人(P<0.01),具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病人中MACC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病人(P<0.01);骨肉瘤組織與正常骨組織MACC1蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),并且 MACC1蛋白表達(dá)與骨肉瘤病人的性別、年齡、腫瘤大小及解剖位置無(wú)關(guān)(P>0.05),但與病人的臨床階段和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05);進(jìn)一步通過(guò)log-rank test(Mantel-Cox)分析表明,

7、具有MACC1高表達(dá)的骨肉瘤病人的存活率顯著低于MACC1低表達(dá)的骨肉瘤病人(P<0.01)。
　　(2)骨肉瘤細(xì)胞中MACC1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于人成骨細(xì)胞hFOB1.19(P<0.05);pcDNA-MACC1組中MACC1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于未處理組和空載體組(P<0.05),而MACC1 siRNA組則出現(xiàn)相反情況(P<0.05);MACC1過(guò)表達(dá)能顯著提高骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖、克隆

8、形成能力和侵襲能力,抑制細(xì)胞凋亡和降低caspase-3的活性,激活MG-63細(xì)胞中Akt信號(hào)途徑,下調(diào)E-cadherin的水平和提高 MMP-2和 MMP-9的水平(P<0.05),而 MACC1表達(dá)的下調(diào)則出現(xiàn)相反的結(jié)果(P<0.05);pcDNA-MACC1組中MG-63細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比率顯著低于未處理組和空載體處理組(P=0.000), S期的細(xì)胞數(shù)比率顯著高于未處理組和空載體處理組(P=0.000),此外,MAC

9、C1 siRNA組中出現(xiàn)相反情況(P=0.000)。
　　(3)與未處理組和空載體對(duì)照組相比,pcDNA-MACC1組中的裸鼠移植瘤的重量、生長(zhǎng)速度、MACC1蛋白的表達(dá)、Ki-67染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞的增殖指數(shù)均顯著升高(P<0.05),然而MACC1 siRNA組中則出現(xiàn)相反的結(jié)果(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　MACC1的高表達(dá)在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及增殖中發(fā)揮重要作用,其高表達(dá)可能成為骨肉瘤病人惡性程度、轉(zhuǎn)