Cav-1與Th17、Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子在慢性阻塞性肺病中的相關(guān)性研究.pdf

1、慢性阻塞性肺?。–OPD）是一種持續(xù)進(jìn)展的以氣流受限為特征的疾病，嚴(yán)重危害人類健康，與接觸有毒顆?；驓怏w的顯著暴露引起的氣道和肺泡異常有關(guān)，致殘率和死亡率極高，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，預(yù)計(jì)2020年將成為全球第三大死亡原因。COPD是可防可治的常見病、慢性病，其急性加重和合并癥嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此探索COPD的發(fā)病機(jī)制可對(duì)該病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。既往關(guān)于COPD的病情發(fā)展主要集中的氣道、肺及肺血管的炎癥反應(yīng)方面的研究。近年來(lái)研究表明

2、，部分 COPD患者即使戒煙，肺內(nèi)炎性反應(yīng)仍持續(xù)進(jìn)展，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等在局部不斷浸潤(rùn)，暗示 COPD為一種慢性自身免疫性的炎癥性疾病，自身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)紊亂參與其發(fā)病過程。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性反應(yīng)已證實(shí)參與了COPD的發(fā)病過程，但 COPD的詳細(xì)的免疫發(fā)病機(jī)制仍不清楚，很多證據(jù)表明一些免疫細(xì)胞，例如Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和炎癥細(xì)胞因子（例如Cav-1，TGF-β，IL-17、IL-10）參

3、與COPD的發(fā)展。細(xì)菌和病毒的急性和慢性感染能加重COPD中的炎癥和激活淋巴細(xì)胞。大量的證據(jù)表明兩種CD4+T細(xì)胞亞群（即Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞）在炎癥性疾病如COPD，哮喘和特發(fā)性肺纖維化的免疫發(fā)病中起關(guān)鍵作用。 Th17細(xì)胞具有促炎癥免疫反應(yīng)的作用且損害組織，Treg細(xì)胞能通過各種機(jī)制控制炎癥和免疫反應(yīng)。最近在 COPD和芥子肺病中觀察到Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量的變化及二者之間的不平衡，并且這種失衡與肺功能相關(guān)。
　　小

4、窩（caveolae），是細(xì)胞膜表面特化的質(zhì)膜凹陷結(jié)構(gòu)，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞基本的生理活動(dòng)，包括轉(zhuǎn)胞吞作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。小窩蛋白是小窩的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，在人體的生理和病理過程中發(fā)揮著更顯著的作用，在人類細(xì)胞中目前已確定小窩蛋白家族中有Cav-1、Cav-2及Cav-3共3個(gè)成員，其中小窩蛋白-1（Cav-1）是小窩表面高表達(dá)且最具標(biāo)志的蛋白，且作為一個(gè)熱門話題，在肺功能障礙的肺中，尤其是呼吸道的纖維化及平滑肌功

5、能等方面被長(zhǎng)期的研究。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1能在急性炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)肺的毛細(xì)血管滲漏，在肺水腫和肺損傷中起潛在作用，同時(shí)在巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DC），淋巴細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞（PBMC）和血清中可被檢測(cè)到。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在脂多糖誘導(dǎo)的氣道炎癥中，Cav-1可以通過抑制一氧化氮合酶的表達(dá)而減少NO的產(chǎn)生，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子-kB（NF-kB）的表達(dá)來(lái)促進(jìn)氣道炎癥；另有學(xué)者的研究結(jié)果顯示，Cav-1表達(dá)減少能改善多形核中性粒細(xì)胞（PMN）

6、活化誘導(dǎo)的肺部炎癥和血管損傷。更重要的研究提示Cav-1的表達(dá)在患有哮喘或具有肺高壓的COPD患者的外周血單核細(xì)胞或血清中急劇下降。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞二者在發(fā)育過程中相互影響，并且Th17和Treg細(xì)胞之間存在重要的可塑性。這些特征表明 Th17/Treg平衡在動(dòng)物模型及人類炎性疾病的發(fā)展和疾病結(jié)果中起重要作用，Treg/Th17失衡的概念在許多疾病中被廣泛的研究，包括在COPD中。因此，我們假設(shè)Cav-1可以通過調(diào)節(jié)Th17/

7、Treg的失衡來(lái)促進(jìn)COPD的發(fā)病過程。
　　在本研究中，我們檢測(cè)了對(duì)照組及COPD患者外周血和血漿中Cav-1、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平以及Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的百分比，并評(píng)估了Cav-1的表達(dá)與Treg或Th17細(xì)胞的百分比以及Th17/Treg比例之間的關(guān)系。
　　目的：
　　Th17和Treg細(xì)胞在自身免疫疾病和慢性炎性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著相反的作用，而 Th17/Treg的平衡越來(lái)越被重視，二者失

8、衡在慢性炎癥性疾病中具有更顯著的作用，慢性阻塞性肺病是其中之一。小窩蛋白-1已被認(rèn)為是慢性炎性呼吸道疾病的病理機(jī)制中的潛在關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。在本研究中，我們旨在檢測(cè)不同時(shí)期COPD及肺功能正常吸煙患者體內(nèi)Cav-1的水平，Treg、Th17細(xì)胞百分比的變化及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，并評(píng)估Cav-1的表達(dá)與Treg和Th17細(xì)胞百分比以及Th17/Treg比值之間的相關(guān)性，觀察Cav-1的缺失是否參與COPD中Th17/Treg之間的平衡的調(diào)

9、節(jié)。
　　方法：
　　選取2014年8月份至2015年7月份于青島大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科就診的肺功能正常的吸煙者23例作為健康對(duì)照組（HC）和50例根據(jù)慢性阻塞性肺病全球倡議（GOLD指南）診斷的COPD患者。將50名COPD患者再細(xì)分為2組：根據(jù)先前描述的COPD惡化標(biāo)準(zhǔn)診斷的26名急性加重期COPD（AECOPD）患者和24名≥3個(gè)月臨床穩(wěn)定期COPD患者（SCOPD）。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法（ELISA）檢測(cè)受試者外周血

10、中的Cav-1、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組及COPD不同時(shí)期血液中Th17、Treg細(xì)胞的含量以及Th17/Treg的比值，并觀察Cav-1的改變與不同時(shí)期COPD患者血液中Th17、Treg細(xì)胞以及Th17/Treg比值變化的相關(guān)性。將血液中分離出來(lái)的PBMC培養(yǎng)24h，將PBMC轉(zhuǎn)染后48h收獲細(xì)胞，并暴露于10％香煙煙霧提取物（CSE）中24h后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+

11、 Treg細(xì)胞和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的百分比，并通過ELISA測(cè)量TGF-β和IL-17的表達(dá)水平，評(píng)估Cav-1的表達(dá)對(duì)COPD患者不同時(shí)期的Th17、Treg細(xì)胞百分比及其細(xì)胞因子IL-17和TGF-β表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.臨床資料分析
　　在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征方面對(duì)三組受試者進(jìn)行了比較：年齡、性別和體重指數(shù)（BMI）方面，組之間沒有差異。性別比例不平等主要是由于在中國(guó)吸煙者及COPD患者

12、在男性中的流行率高于女性。肺功能測(cè)試結(jié)果顯示：與對(duì)照組（HC）相比，COPD患者的FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred均顯著降低，而RV/TLC與HC組相比顯著升高（P＜0.01）。另外，AECOPD組患者與SCOPD組患者相比，F(xiàn)EV1值降低（P＜0.05）；FEV1/FVC、FEV1%pred顯著降低，RV/TLC顯著升高（P＜0.01）。
　　2. COPD患者血漿中Cav-1的水平和外周血中Treg細(xì)胞和Th17

13、細(xì)胞的百分比
　　為了研究Cav-1表達(dá)水平與Treg和Th17細(xì)胞的百分比之間的關(guān)系，我們通過ELISA測(cè)量血漿Cav-1的表達(dá)，以及外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+IL-17+Th17細(xì)胞含量的百分比。在穩(wěn)定期COPD（SCOPD）和急性加重期COPD（AECOPD）以及健康對(duì)照（HC）受試者中的 FCM，ELISA分析表明，與 HC組相比，COPD患者的Cav-1水平顯著降低（P＜0.01）。SCOP

14、D患者的Cav-1水平明顯低于AECOPD患者（P＜0.05）。除了降低的Cav-1水平，SCOPD組與AECOPD和HC組相比，Treg細(xì)胞的百分比顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。而與 SCOPD和 HC組相比，AECOPD組的Th17細(xì)胞的百分比顯著增加（P＜0.01）。有意思的是，AECOPD患者外周血中 Treg細(xì)胞的百分比顯著低于 HC組。對(duì)于 Th17細(xì)胞百分比的變化，SCOPD和 HC組之間沒有顯著差異。我們的結(jié)果

15、提示 AECOPD患者的 Th17/Treg比值最高，SCOPD患者的Th17/Treg比值與HC組相比顯著下降。
　　3. COPD患者外周血中TGF-β和IL-17的水平
　　患者的增強(qiáng)免疫抑制由 Treg產(chǎn)生的免疫抑制細(xì)胞因子 TGF-β的血漿水平的不同增量反映。在SCOPD患者體內(nèi)，TGF-β明顯升高；相比之下，在患有AECOPD的患者中，Th17產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-17的外周血水平顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)與循環(huán)中Tr

16、eg和Th17細(xì)胞的百分比的變化一致。
　　4. Cav-1表達(dá)水平與Treg和Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg比值之間的相關(guān)性
　　我們的實(shí)驗(yàn)觀察到 HC組中 Cav-1的水平與 Treg和 Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg的比值沒有顯示任何相關(guān)性。COPD患者中 Cav-1水平降低顯示與 Treg細(xì)胞的百分比呈負(fù)相關(guān)，與Th17細(xì)胞的百分比和Th17/Treg細(xì)胞的比值呈正相關(guān)，提示Cav-1水平的變化在

17、COPD患者體內(nèi)Th17/Treg比值失衡中可能起不可忽視的作用。
　　5. Cav-1表達(dá)水平的變化影響Treg和Th17細(xì)胞的百分比
　　為了評(píng)估Cav-1表達(dá)的改變是否影響Treg和Th17細(xì)胞的百分比，用Cav-1質(zhì)?；駽av-1-siRNA轉(zhuǎn)染來(lái)自COPD的患者的PBMC，然后暴露于10％CSE24小時(shí)，如實(shí)驗(yàn)方法章節(jié)所述。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果分析顯示Cav-1的過表達(dá)導(dǎo)致Treg細(xì)胞的百分比降低和Th17細(xì)胞的百分

18、比增加，而Cav-1的表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)Treg細(xì)胞百分比的升高并降低 Th17細(xì)胞的百分比，TGF-β和 IL-17的表達(dá)水平的變化規(guī)律與Treg和Th17的百分比的變化規(guī)律一致。
　　結(jié)論：
　　1. Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子均參與了COPD的發(fā)病過程，且兩者在COPD病情發(fā)展過程中的作用相反。COPD患者體內(nèi)存在Th17和Treg細(xì)胞比例的失衡，二者比值可以作為COPD疾病進(jìn)展的標(biāo)志。
　　2. C

19、OPD患者體內(nèi)的Cav-1表達(dá)水平明顯降低。
　　3.血漿Cav-1水平的降低能提高COPD患者外周血中Treg細(xì)胞的百分比并降低外周血中Th17細(xì)胞的百分比。
　　4. COPD患者中Cav-1的表達(dá)水平與Treg細(xì)胞的百分比、TGF-β的水平呈負(fù)相關(guān)，與Th17細(xì)胞的百分比、IL-17的水平和Th17/Treg細(xì)胞的比值呈正相關(guān)。
　　5. Cav-1參與Th17/ Treg之間的失衡，從而破壞COPD患者肺內(nèi)發(fā)生