優(yōu)化型十拷貝rolGLP-1在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其應(yīng)用研究.pdf

1、目前，全球糖尿病患者有近3億，隨著人們生活節(jié)奏和生活方式的變化，糖尿病正在逐漸蔓延且發(fā)病人群向年輕化發(fā)展，糖尿病已成為威脅人類健康的重要慢性流行疾病，目前市場急需標(biāo)本兼治的糖尿病治療藥物。
　　促胰島素(Incretin)又稱胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，能通過胰島β細(xì)胞表面的特異受體顯著增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，有效降低糖尿病患者血糖水平，促進(jìn)胰島β細(xì)胞胰島素基因轉(zhuǎn)錄和分泌，

2、促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，改善和恢復(fù)胰島細(xì)胞功能;防止糖尿病各種并發(fā)癥，抑制胰升血糖素的分泌和糖尿病患者胃的排空，消除其饑餓感，降低血脂，預(yù)防冠心病;GLP-1的促胰島素作用依賴于葡萄糖的濃度，用其治療糖尿病不會(huì)發(fā)生低血糖，被認(rèn)為是一種“治標(biāo)治本”的糖尿病治療多肽，對2型糖尿病的預(yù)防和治療具有重要意義。
　　人體內(nèi)胰高血糖素樣肽以有活性的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺形式存在，但是其N端第8位的丙

3、氨酸極易被二肽酶(DPPⅣ)切割變成無活性的短肽GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)，半衰期僅數(shù)分鐘，成為GLP-1進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用的主要瓶頸。因此，開發(fā)更穩(wěn)定的GLP-1類似肽，延長其體內(nèi)有效作用時(shí)間成為近年來的熱門課題。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過點(diǎn)突變天然GLP-1，克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶降解的重組口服長效GLP-Ⅰ類似肽(recombinant oval long-acting GLP-1，rolGLP-1)。動(dòng)物實(shí)

4、驗(yàn)證明，GLP-M蛋白(10 tandem repeated rolGLP-1)可顯著降低糖尿病大鼠血糖水平，改善了由于高血糖引起的異常體征，對2型糖尿病具有良好的治療效果。由于GLP-M中各拷貝rolGLP-1之間通過酶切連接，導(dǎo)致兩個(gè)相鄰rolGLP-1之間多出三個(gè)氨基酸（脯氨酸-異亮氨酸-精氨酸），并且為了便于蛋白純化，GLP-M的C端設(shè)計(jì)了純化標(biāo)簽(6×His)，于是在GLP-1的完整序列外添加了一些冗余氨基酸，雖然短期看不出冗

5、余氨基酸的副作用，但是不能保證長期使用的安全性，而且影響新藥審批。為此，我們委托北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biological Technology Co.，Ltd，Beijing)合成了十拷貝rolGLP-1全基因，利用分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建表達(dá)優(yōu)化促胰島素(Optimized rolGLP-1， Opt-rolGLP-1）的大腸桿菌工程菌株，能保證各拷貝之間的無縫連接(無任何多余的氨基酸）。
　　大腸桿菌工

6、程菌株F,.coli BL21(DE3)/Opt-rolGLP-1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE和Western Blotting結(jié)果證明實(shí)現(xiàn)了Opt-rolGLP-1在大腸桿菌的高效分泌表達(dá)，對其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明Opt-rolGLP-1的最佳表達(dá)條件為IPTG終濃度為1mM，25℃下培養(yǎng)8h。誘導(dǎo)后菌體經(jīng)過超聲破碎，采用陰離子交換層析和凝膠過濾層析，成功純化出純度高達(dá)98％的Opt-rolGLP-1，滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求

7、。
　　Opt-rolGLP-1中每個(gè)拷貝rolGL,P-1 C端的最后一個(gè)氨基酸恰好是精氨酸（胰蛋白酶識別位點(diǎn)），體外酶切實(shí)驗(yàn)證明，Opt-rolGLP-1可被胰蛋白酶識別并切割成單拷貝rolGLP-1。
　　通過對C57BL/6J小鼠進(jìn)行高脂高糖飲食合并腹腔注射小劑量(mg/kg)鏈脲佐菌素，兩次成功構(gòu)造2型糖尿病小鼠模型，證明此造模方法成熟穩(wěn)定。糖尿病小鼠經(jīng)過灌胃Opt-rolGLP-1和單拷貝rolGLP-1或皮下注

8、射單拷貝rolGLP-1治療后，小鼠飲食飲水量有所下降，因高血糖導(dǎo)致的體重下降現(xiàn)象也被遏止，而且小鼠的糖化血紅蛋白、膽固醇、甘油三酯含量明顯下降，高胰島素血癥和口服糖耐量都得到有效改善。此外Opt-rolGLP-1和rolGLP-1能上調(diào)糖尿病小鼠肝臟GLUT2、INSR、GCK mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)肝臟PGC-1αmRNA的表達(dá)量，這可能是Opt-rolGLP-1和rolGLP-1治療糖尿病的重要分子機(jī)制之一。
　　本研