中國人原發(fā)性膽汁性肝硬化相關基因多態(tài)性研究.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化，是由免疫紊亂介導的慢性進行性非化膿性膽管炎性疾病，可引發(fā)肝內中小膽管的損傷和肝內膽汁淤積，病理表現(xiàn)為膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實質碎屑狀壞死，最終可進展為肝硬化。近年來，隨著環(huán)境污染的加重、生活方式的日益西化，以及醫(yī)生對該病認知程度的提高，PBC在中國的檢出率逐年升高。目前認為，PBC是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下，經(jīng)由免疫反應介導的一種自身免疫性疾病。許多報道顯示，PBC發(fā)病具有明顯的家族聚集現(xiàn)

2、象;雙胞胎發(fā)病率顯著增高; PBC一級親屬發(fā)病率比正常人發(fā)病率高100倍。這些都提示，遺傳因素在PBC的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。國外對PBC的基因易感位點進行了大量的研究。通過文獻分析，高加索人和亞洲人的PBC相關SNP位點存在著明顯差異。這些基因的不用位點或不同位點的單倍型均不同程度的顯示與 PBC易感性有關。大量文獻顯示，東西方人群對比顯示不同種族或民族的基因多態(tài)性存在很大差異，提示歐美結果不能反映中國人的情況，又因為目前國內

3、這方面的研究較少，所以本研究通過研究候選基因多態(tài)性進行中國人PBC相關基因易感多態(tài)性研究。
　　目的：
　　篩選中國人群中PBC基因易感位點，從影響人群膽汁分泌與排泄功能、小膽管損傷、免疫紊亂等方面，探討基因多態(tài)性對PBC遺傳易感性的影響。
　　方法：
　　通過大量文獻回顧查閱已經(jīng)報道的東西方人群中與自身免疫性疾病相關的SNP位點及基因，并根據(jù)當前研究的與免疫性疾病相關SNPs，分析已發(fā)現(xiàn)的一些可能與PBC發(fā)病相

4、關SNPs位點，最終確定本課題將要篩選的基因。收集 PBC患者及對照全血，用SNP芯片檢測易感基因位點，通過質譜分析得出基因分型結果并結合疾病相關臨床指標等對其進行多層統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　?。?）根據(jù)目前已經(jīng)報道的與原發(fā)性膽汁性肝硬化以及與自身免疫性疾病和肝臟疾病相關的基因SNPs。針對參與免疫調節(jié)、膽汁排泄、膽管上皮損傷機制的19個基因中的49個SNPs設計引物并合成芯片。其中參與T細胞增殖、陽性選擇的分子包括 P

5、TPN22、CTLT-4及HLA類分子。參與 Th1細胞分化的分子包括IL-12、IRF5、STAT4、IFN-γ及Tyk2等分子。參與膽汁合成、轉運及排泄的分子包括 MDR1、MDR3、BSEP、MRP2、CYP、AE2等。
　?。?）2004年7月到2011年8月共入組448例樣本：PBC患者（134例），對照（314例）。
　　（3）經(jīng)病例-對照分析基因型頻率分布，定位于BSEP基因的rs473351，兩組具有顯著性差

6、異（P=0.004）。定位于 STAT4基因的rs6748358，兩組具有顯著性差異（P=0.009）。定位于PTPN22基因的rs738409，兩組具有顯著性差異（P=0.020）。其余各點的基因型頻率分布均無顯著性差異。
　　（4）經(jīng)顯性模型、隱性模型以及共顯性遺傳模型分析，BSEP基因的位點rs473351與PBC的易感性有關，其突變堿基A（dominant model:OR,2.063；95％CI,1.254-3.393;

7、P=0.004）與PBC的易感性具高度相關性。位點rs2287618與PBC的易感性有關，其突變堿基A（dominant model, OR,0.617;95％CI，0.411-0.928; P=0.020）與PBC的易感性具高度相關性。STAT4 rs6748358與PBC的易感性有關，其突變堿基 A（dominant model, OR,1.567;95％CI，1.044-2.353;P=0.030）與PBC的易感性具高度相關性。<

8、br>　?。?）BSEP中rs473351與rs2287618具有高度連鎖性LD(D’>0.9)它們與定位在 BSEP的其他兩個位點不存在連鎖關系。多因子降解法分析顯示：基因 STAT4-PNPLA3位點 rs738409、rs2235048、 rs2280714、 rs10181656次要位點組合的攜帶者，患病危險率顯著高于其他人?；駼SEP-STAT4位點rs280519、rs473351、rs2280714、rs2461823、

9、rs10181656次要位點組合的攜帶者，患病危險率顯著高于其他人。
　?。?）本研究納入臨床資料收集完整的PBC患者（96例），對BSEP基因多態(tài)性及臨床指標（ALP、GGT、TBIL）相關性進行 Logistic回歸分析，結果顯示，攜帶rs2287618次要等位基因的個體與ALP值呈正相關（P<0.05）。同時，攜帶rs2287618次要等位基因的個體對UDCA的應答水平降低，具有統(tǒng)計學意義。
　?。?）對PBC相關抗體

10、與BSEP基因多態(tài)性進行分析，結果顯示，AMA陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，二者具有顯著性差異。同時，Sp100抗體陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，具有統(tǒng)計學意義。而BPO、gp210等抗體陽性率與攜帶此位點次要等位基因頻率比較，二者無顯著性差異。主要細胞因子，我們對21例PBC患者和21例對照進行了Wilcoxon秩和檢驗分析。IL-4、IL-10的表達水平在病例組和對照組具有顯著

11、差異（P值分別為0.04，0.033）；IL-2、IL-12、IL-17檢測結果顯示，PBC組與對照組無顯著性差異（P值分別為0.24，0.12，0.07）。進一步進行 BSEP基因多態(tài)性與 IL-4、IL-10表達水平的邏輯回歸分析，結果沒有顯著差異。
　　結論：
　?。?）從遺傳易感性角度篩選到了PBC相關SNPs：rs473351、rs2287618、rs6748358、rs738409等，首次發(fā)現(xiàn)基因 BSEP位點

12、rs473351，STAT4位點rs6748358，PTPN22位點rs738409的基因型分布在中國PBC患者中存在顯著性差異；等位基因同樣存在顯著性差異；說明這些位點多態(tài)性可能與PBC的發(fā)病機制有關。
　　（2）首次對BSEP的基因多態(tài)性與PBC易感性關系的深入研究。遺傳模型證實突變BSEP可能是參與PBC發(fā)病的候選分子。模型分析顯示為BSEP基因位點rs473351、位點rs2287618，STAT4基因位點rs674835

13、8，攜帶A等位基因的人群患PBC的風險明顯增高。而rs473351的突變型致病性更強。由此可以看出，BSEP可能在PBC的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。
　?。?）BSEP基因的rs473351、rs2287618存在緊密連鎖。進一步對其進行單倍型分析，結果顯示單倍體 AA（均為次要等位基因）顯著降低了PBC的發(fā)病率。相反,如果患者出現(xiàn) GG單倍型，則其發(fā)病率顯著增高。說明其對PBC的發(fā)病可能起到了不可忽視的作用。進行MDR分析后

14、，同時攜帶分別定位于BSEP、STAT4基因的次要等位基因位點組合的人群患PBC的概率顯著增高。同樣，攜帶STAT4、PNPLA3基因的次要等位基因位點組合的人群發(fā)生PBC的概率顯著高于其他人。這提示要對基因BSEP、STAT4以及其在免疫性疾病中的連鎖關系高度關注。
　　（4）ALP、GGT、TBIL是評估病情、判斷預后的重要指標。首次對BSEP基因多態(tài)性與 PBC相關臨床指標進行邏輯回歸分析，結果顯示 BSEP rs22876

15、18與ALP具有相關性，提示BSEP rs2287618可能是PBC的獨立危險因素。一致率檢驗顯示，判別UDCA應答的兩種標準（Barcelona標準和PairsⅠ標準）具有良好的一致性。首次進行BSEP基因多態(tài)性與UDCA應答率（采用Barcelona標準）的邏輯回歸分析，攜帶rs2287618次要等位基因的個體對UDCA的應答水平降低。這些都提示：BSEP rs2287618具有重要的研究意義。
　?。?）首次對BSEP基因多