Bt PP61 cry1Ib2基因的克隆表達(dá)及其表達(dá)的蛋白對柑橘鳳蝶的生物活性研究.pdf

1、本研究以從魚尾葵上分離的PP61菌株上尋找新的cry基因表達(dá)的Cry蛋白對柑橘風(fēng)蝶有效活性為目的，對Bt PP61菌株進(jìn)行一系列的生理生化分析，推測PP61可能屬庫斯塔克亞種。采用PCR-RFLP技術(shù)對PP61菌株所含cry基因進(jìn)行分析，含有編碼ICP的cry1Ba、cry1Cb、cry1Ib和cry2Ab等基因。自1995年Shin等克隆cry1Ib1基因后，并未有后續(xù)研究報道。因此，本研究從Bt PP61中克隆得到的cry1Ib基因

2、全長2160 bp，編碼719Aa的蛋白，該蛋白分子量和等電點通過軟件預(yù)測分別為81.39 kDa和6.425。cry1Ib已在GenBank上登錄，登錄號為EU233027，并被Bt δ-內(nèi)毒素國際基因命名委員會正式命名為cry1Ib2。在線BLAST軟件分析表明推導(dǎo)的Cry1Ib2與已報道的Cry1I蛋白具有很高的氨基酸序列同源性。信號肽分析說明Cry1Ib蛋白的前端沒有信號肽，它是一種胞內(nèi)蛋白。用在線Conserved Domai

3、n Search工具進(jìn)行保守功能區(qū)分析，推導(dǎo)出Cry1Ib2蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)功能域主要包含有：位于毒素分子N端的結(jié)構(gòu)域Ⅰ、位于C端的結(jié)構(gòu)域Ⅲ及位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ之間的結(jié)構(gòu)域Ⅱ，其中N端結(jié)構(gòu)域參與了細(xì)胞膜的穿孔與芽孢的形成，后兩者則參與了與膜受體蛋白的識別和結(jié)合。對Cry1Ib2的二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，25％為α-螺旋，28％為β-片層，18％為β-轉(zhuǎn)角，29％為無規(guī)則線圈。 通過將cry1Ib2與

4、pET29a(+)表達(dá)載體連接，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEt29a-cry1Ib2，并成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。陽性克隆子通過PCR和核酸測序得以驗證。cry1Ib2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)。SDS-PAGE分析說明表達(dá)的融合蛋白(包含(His)6 tag)為81 kDa左右，與ExPASy軟件預(yù)測的基本一致。蛋白可溶性試驗說明該表達(dá)產(chǎn)物部分可溶。生物測定表明表達(dá)產(chǎn)物對5齡柑橘鳳蝶幼蟲具有殺蟲活性，并且對其生長也表現(xiàn)出