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1、以蘇云金芽胞桿菌(簡稱Bt)標準菌株HD-1總DNA為模板,通過PCR方法擴增crylA基因,將PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,構(gòu)建克隆重組菌pMD18T-crylA,經(jīng)測序與分析,得到的基因為完整的ORF3531bp,編碼1176個氨基酸,分子量為133128Da,等電點5.02。通過NCBI BLAST軟件分析比對其核苷酸序列,結(jié)果顯示該基因與crylAal,crylAcl均有99％的同源性。經(jīng)Bt命名委員會命名為新基因cr
2、ylAa21,NCBI登錄號為JF699284。
將crylAa21基因與pET32a表達載體連接,構(gòu)建BL21-pET32a-crylAa21重組菌。SDS-PAGE分析表明目的蛋白為150 kDa左右,其中包含20 kDa左右的HIS標簽。提取CrylAa21蛋白,以未誘導(dǎo)蛋白和原始菌株HD-1的晶體蛋白為對照,研究對小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)和褐飛虱Nilaparvata lugens(St
3、al)的生物活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CrylAa21蛋白和HD-1晶體蛋白對小菜蛾48小時的LC50分別為2.429μg／mL和0.691μg／mL。利用人工飼料膜飼喂法,在72小時內(nèi)對褐飛虱進行CrylA蛋白和Bt晶體蛋白的活性驗證。在CrylAa21蛋白12700μg／mL到0.0127μg／mL的系列濃度下,HD-1在15900μg／mL到0.0159μg／mL的系列濃度下,都對褐飛虱的4、5齡若蟲和成蟲死亡率無顯著影響。CrylAa21和
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