PI3K-AKT信號傳導通路在血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及靶向該通路治療血管瘤的實驗研究.pdf

1、目的
　　 血管瘤是一種常見的血管內(nèi)皮腫瘤，在我國的發(fā)病率約為0.3％～1%，具有一系列廣泛的臨床表現(xiàn)。從良性的嬰幼兒血管瘤，惡性度低的血管內(nèi)皮瘤，到多發(fā)于成人的惡性血管肉瘤。血管瘤及相關的血管畸形可見于多種先天性遺傳性疾病，通常伴有多種組織器官發(fā)育缺陷。到目前為止，血管瘤形成的分子及細胞學機制仍然不清。與正常血管內(nèi)皮細胞相比，血管瘤內(nèi)皮細胞增殖、侵襲能力增強。血管內(nèi)皮細胞過度增殖，病理性血管生成是血管瘤形成的主要生物學行為。P

2、I3 K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在廣泛的人類腫瘤譜中失調(diào)，該通路某些成分的突變所導致的功能獲得或功能缺失能夠引起細胞轉(zhuǎn)化，該通路是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生存、血管生成的主要信號調(diào)節(jié)途徑，在血管瘤中表現(xiàn)出異常激活。VEGF是該信號通路主要的信號刺激因子。AKT是該信號通路的中心調(diào)控點，其完全磷酸化由Thr308和Ser473磷酸化組成。AKT Thr308磷酸化由上游激酶PDK1激活，而Ser473則由mTORC2磷酸化激活。AKT完全磷酸化是其發(fā)揮生

3、物學功能所必需的。哺乳動物AKT有三種亞型：Akt1，Akt2 and Akt3。這三種亞型由嚴格區(qū)分卻又高度同源的基因編碼。特異性AKT亞型基因敲除鼠研究表明，不同AKT亞型表現(xiàn)出不同的功能。目前，AKT亞型特異性功能研究成為腫瘤研究中的熱點。雷帕霉素是mTOR抑制劑，根據(jù)不同細胞類型發(fā)揮不同程度的mTORC1和mTORC2抑制作用，動物研究表明，雷帕霉素可以顯著抑制實體瘤中AKT的活性及病理性血管生成。本研究探討血管瘤中AKT信號傳

4、導通路的調(diào)節(jié)作用；通過慢病毒介導的shRNA靶向沉默AKT磷酸化的上游激酶PDK1、mTORC2-RICTOR，探討這兩種AKT上游激酶對AKT活性及血管瘤的生長、增殖及侵襲的影響及其作用機制；探討低劑量雷帕霉素對血管瘤的治療作用；探討AKT三種亞型對良、惡性血管瘤生長、增殖、侵襲的影響及其作用機制。
　　 實驗材料：
　　 實驗用EOMA細胞，293T細胞由哈佛醫(yī)學院，Laura Benjamin實驗室提供，嬰兒血管瘤

5、組織、原代嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞、人皮膚微血管內(nèi)皮細胞、ASM.5細胞及正常人皮膚組織、小鼠血管內(nèi)皮細胞由哈佛醫(yī)學院Carole Perruzzi友情贈送及技術支持。實驗動物為裸鼠，4-6周，雌性(Charles River，MA)。實驗所用AKT信號通路相關抗體、VEGF/VEGF受體等抗體均購于Cell SignalingTechnology。LY-294002(L9908)購于Sigma。
　　 實驗方法：
　　 1、

6、慢病毒介導的shRNA靶向基因沉默靶向PDK1、RICTOR、AKT1、AKT2、AKT3的小鼠shRNA序列克隆到pLKO慢病毒表達載體中。該質(zhì)粒由哈佛大學LeslieWardwell，RNAi Facility，Dana-Farber Cancer Institute構建。在293T細胞內(nèi)包裝成慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染靶細胞。
　　 2、Western Blot方法檢測各種蛋白激酶激活及表達情況。
　　 細胞經(jīng)含有蛋白酶及磷

7、酸酶抑制劑的細胞裂解液作用后，提取細胞總蛋白，調(diào)節(jié)蛋白濃度均等，在4%-20%的Tris-Glycine膠上上樣，每孔蛋白量為20ug。電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入適當比例稀釋的一抗孵育過夜，第二天加入HRP標記的二抗作用后，進行膜孵育及曝光檢查蛋白表達情況。
　　 3、利用WST-1細胞增殖檢測法檢測血管瘤細胞增殖能力。
　　 4、Transwell Matrigel方法檢測血管瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 5

8、、體外出芽實驗檢測血管瘤細胞新生血管形成能力。
　　 6、免疫組織化學方法檢測幾種人類良、惡性血管瘤中AKTSer473位點磷酸化表達情況。
　　 結果：
　　 1、人血管瘤中AKT磷酸化活性異常增高福爾馬林固定，石蠟包埋的人良、惡性血管瘤組織經(jīng)AKT磷酸化Ser473位點的抗體染色，結果表明，與鄰近的正常血管組織比較，在所選血管瘤組織中，都表現(xiàn)出AKT Ser473磷酸化表達增強。
　　 2、慢病毒介導

9、的shRNA靶向沉默PDK1、RICTOR及AKT三種亞型的表達Western Blot結果表明，shRNA成功抑制了各個靶蛋白的表達，獲得了穩(wěn)定沉默靶蛋白的血管瘤細胞。
　　 3、PDK1、RICTOR基因表達沉默下調(diào)AKT磷酸化水平，從而抑制血管瘤生長、增殖及侵襲Western Blot結果表明：PDK1、RICTOR基因沉默分別抑制AKT在Thr308位點和Ser473位點的磷酸化。與EOMA空白對照組相比，PDK1、RI

10、CTOR基因沉默明顯抑制腫瘤細胞生長、增殖及侵襲。靶向PDK1、RICTOR基因治療將會是血管瘤治療的一條新途徑。
　　 4、小鼠活體內(nèi)實驗表明雷帕霉素可以顯著抑制血管瘤的生長。
　　 裸鼠側(cè)腹注射EOMA細胞，分別給與DMSO及雷帕霉素(0.1ng/ml)每日腹腔注射，治療12天。有研究表明，該治療劑量血中雷帕霉素濃度約為5.47ng/ml，這一濃度正處于雷帕霉素臨床治療用藥濃度的下限(6-15ng/ml)[1]。與對

11、照組相比較，在較低用藥劑量下，雷帕霉素發(fā)揮顯著的血管瘤生長抑制作用。證明了雷帕霉素在血管瘤治療中的重要意義。
　　 5、AKT1促進腫瘤生長、增殖及侵襲，而AKT3則發(fā)揮明顯的抑制作用。
　　 AKT1和AKT2表達缺失明顯抑制而AKT3表達缺失則明顯促進血管瘤細胞基礎的及VEGF誘導的新血管形成過程。與pLKO對照組比較，AKT1表達缺失明顯抑制血管瘤生長，而AKT3表達缺失則顯著促進血管瘤生長。AKT2表達缺失沒有顯

12、著的統(tǒng)計學差異。除了腫瘤大小外，沒有觀察到AKT三種亞型對血管瘤組織形態(tài)特征及局部侵襲能力的明顯區(qū)別。AKT1促進而AKT3抑制血管瘤生長、增殖及侵襲，這表明AKT1為血管瘤生長所必需，而AKT3則發(fā)揮完全相反的負性調(diào)節(jié)作用，這為研制開發(fā)AKT亞型特異性抑制劑提供了重要的理論基礎。
　　 結論：
　　 本研究證實，血管瘤中存在AKT信號傳導通路的異常過度激活；靶向沉默AKT磷酸化上游激酶--PDK1、mTORC2-RIC

13、TOR可以降低AKT磷酸化活性，從而顯著抑制血管瘤生長、增殖及侵襲能力；AKT1和AKT3在血管瘤的生長、增殖及侵襲過程中具有完全相反的調(diào)節(jié)作用--AKT1促進而AKT3顯著抑制血管瘤生長。另外，本研究還證實低濃度雷帕霉素具有顯著的抑制血管瘤生長的作用，顯示出雷帕霉素重要的抗血管瘤臨床應用價值。除此之外，對血管內(nèi)皮細胞腫瘤形成機制的研究和深入理解，將為內(nèi)皮細胞生物學研究提供堅實的理論基礎，幫助我們更好的理解其他的與病理性血管生成相關的疾