綿羊NOS基因的克隆及其在布魯氏菌侵染過程中的作用.pdf

1、目的：通過對(duì)中國美利奴羊eNOS基因編碼區(qū)SNP位點(diǎn)利用SSCP的方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)有多態(tài)性位點(diǎn)的外顯子進(jìn)行克隆，找出與布病易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)。用布魯氏菌M5侵染小鼠后對(duì)小鼠eNOS基因的濃度、酶活力進(jìn)行測(cè)定并對(duì)肝、脾組織中eNOS基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，探討了中國美利奴羊eNOS基因與布魯氏菌病易感性相關(guān)性及布魯氏菌侵染過程中eNOS的作用，為選育綿羊抗病新品種及布病預(yù)防尋求新途徑提供一定依據(jù)和理論支持。
　　方法：⑴將人、綿羊

2、 eNOS基因 mRNA序列（登錄號(hào)：NM_000603.4、NM_001129901.1）利用 BLAST比對(duì)分析找出人、綿羊eNOS基因的外顯子序列，再通過GenBank中的SNP數(shù)據(jù)庫查找人和綿羊的SNP位點(diǎn)。利用DNAMAN6.0軟件對(duì)人eNOS基因外顯子上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得多態(tài)性較為豐富的人 eNOS基因外顯子序列，再利用 GeneDoc軟件比對(duì)找出與這些外顯子相似性較高的綿羊eNOS基因外顯子序列。⑵利用布魯氏菌虎紅

3、平板凝集診斷試劑盒對(duì)162只中國美利奴羊血液樣本進(jìn)行布魯氏菌血清檢測(cè)，然后利用PCR-SSCP方法對(duì)eNOS基因外顯子的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，后對(duì)含有SNP位點(diǎn)的外顯子進(jìn)行克隆測(cè)序。通過SHEsis在線分析軟件對(duì)檢測(cè)出的SNP位點(diǎn)進(jìn)行布病易感性分析。⑶用布魯氏菌M5侵染小鼠，分別在侵染后第0、3、7、14、28天檢測(cè)小鼠eNOS的含量和活力，將測(cè)得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入EXCEL中，利用SPSS17.0對(duì)侵染組和對(duì)照組的含量和活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。⑷用熒

4、光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)侵染第28天小鼠和對(duì)照組小鼠eNOS基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過2-△△Ct法分析和修正數(shù)據(jù)，最后將所得結(jié)果導(dǎo)入 EXCEL中，得到肝、脾組織相對(duì)表達(dá)量，對(duì)生成的各個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
　　結(jié)果：①通過生物信息學(xué)分析，找到與人同源性高的中國美利奴羊eNOS基因的10個(gè)外顯子，這10個(gè)外顯子分別是exon2、exon7、exon8、exon13、exon14、exon16、exo

5、n17、exon18、exon19、exon20而在人的這10個(gè)外顯子中多態(tài)性較為豐富。②對(duì)162只中國美利奴羊進(jìn)行虎紅平板檢測(cè)，共檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陰性101只，陽性個(gè)體為61只，并對(duì)出現(xiàn)的陽性樣本進(jìn)行復(fù)檢，布魯氏菌檢出率為37.65％。利用PCR-SSCP的方法對(duì)這162只中國美利奴羊eNOS基因10個(gè)外顯子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊eNOS基因exon8序列第142位發(fā)生了堿基突變，由G變?yōu)锳，氨基酸由Ala變?yōu)門hr，該突變位點(diǎn)也是一個(gè)新

6、的突變位點(diǎn)（ss974768653：A142G）。利用SHEsis在線統(tǒng)計(jì)分析軟件和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果表明該多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weiberg平衡定律（P>0.05），具有群體代表性，但該位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分別在侵染組和對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。③用布魯氏菌 M5侵染小鼠后，發(fā)現(xiàn)在侵染后第14天出現(xiàn)了肝、脾腫大。在第0、3、7、14、28天分別測(cè)定侵染組和對(duì)照

7、組eNOS含量和活力，通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)侵染組和對(duì)照組eNOS含量沒有發(fā)生變化，而eNOS活力在侵染后的第14天開始升高。4、利用實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)侵染第28天和對(duì)照組中小鼠肝、脾eNOS基因進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)侵染組中肝和對(duì)照組中肝的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著,P值為0.685（P>0.05）；在侵染組和對(duì)照組中脾的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，P值為0.512（P>0.05）。
　　結(jié)論：⑴經(jīng)過PCR-SSCP方法對(duì)中國美利奴羊eNOS基因的10個(gè)外

8、顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，最終在exon8上發(fā)現(xiàn)1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，但是該多態(tài)性位點(diǎn)與綿羊布病易感性無關(guān)。⑵對(duì)侵染后的小鼠eNOS含量和活力進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，eNOS含量在侵染后沒有發(fā)生明顯變化，而eNOS活力在侵染后第14天出現(xiàn)升高，說明布魯氏菌侵染小鼠后，并沒有引起eNOS含量的變化，而在第14天以后引起eNOS活力升高，這一過程也可能導(dǎo)致NO釋放量升高。⑶利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)侵染組和對(duì)照組小鼠肝、脾進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析后發(fā)現(xiàn)侵染組中肝和對(duì)