突變對家蠶1型乙酰膽堿酯酶基因結(jié)構(gòu)及功能的影響研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinestrase，AChE，EC3.1.1.7）是一種重要的絲氨酸水解酶，其經(jīng)典功能是在神經(jīng)傳導中，將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)催化水解為乙酸和膽堿，終止神經(jīng)沖動，維持正常的神經(jīng)傳導。AChE主要存在于神經(jīng)元和肌肉接頭處，終止神經(jīng)沖動向肌肉細胞的正常傳遞。AChE是有機磷(OPs)和氨基甲酸酯(CBs)類殺蟲劑的作用靶標。殺蟲劑與AChE活性中心位點絲氨酸殘基結(jié)合，占據(jù)酶的

2、催化區(qū)域，ACh不能進入和降解。ACh長時間結(jié)合在乙酰膽堿受體（AChR）上，持續(xù)刺激肌肉細胞，引起昆蟲抽搐甚至死亡。此外，AChE還與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)細胞分化與遷移、突觸的形成有關(guān);AChE參與造血細胞的增殖與分化，參與巨核細胞的形成;AChE還與腫瘤增殖、細胞凋亡有關(guān)。
　　AChE表達量的增加、膜錨定的增加、特定位點的突變是昆蟲抗藥性增加的重要原因。家蠶AChE有兩種類型（AChE1和AChE2），家蠶AChE1對農(nóng)藥相對敏感

3、。為了研究特定位點的突變(A286S、G312A、L537S)對家蠶AChE1結(jié)構(gòu)、活性以及對農(nóng)藥敏感性的影響，本研究利用原核表達系統(tǒng)表達了突變前后的AChE1基因（wace1和mace1），經(jīng)過分離和純化制備了有活性的AChE，研究了活性及抑制動力學的變化;對突變前后的AChE1結(jié)構(gòu)進行了預測，分析了影響AChE1功能的原因;將wace1及mace1轉(zhuǎn)入BmN細胞，研究其在細胞中的表達特征，并進一步確定突變對AChE1活性及抑制動力學

4、的影響;構(gòu)建了家蠶通用型基因打靶載體(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)，并利用此載體對BmN細胞ace1進行敲除;將mace1轉(zhuǎn)入到家蠶，構(gòu)建攜帶mace1的家蠶。主要研究結(jié)果如下:
　　1.wace1和mace1的原核表達及功能分析
　　為了研究突變對AChE1活性和抑制動力學的影響，本研究利用原核表達系統(tǒng)，對家蠶野生型AChE1（wAChE1）和突變型AChE1(mAChE1)進行了表達;經(jīng)過復性

5、和純化得到有活性的AChE1，兩者活性差異不顯著;用10-6M的毒扁豆堿和10-3mg/mL的辛硫磷孵育后，mAChE1的剩余酶活力分別比wAChE1高4.42％和8.86％。結(jié)果表明，突變對AChE1酶的活性無明顯影響，但降低了其的對毒扁豆堿和辛硫磷的敏感性。
　　2.wAChE1和mAChE1的結(jié)構(gòu)分析
　　為了探究突變對AChE1結(jié)構(gòu)的影響，本研究對突變前后AChE1的二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)進行了預測和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變

6、改變了AChE1的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)，影響了催化活性中心部位的空間構(gòu)象。A286S、G312A突變后的氨基酸殘基大于原先的殘基，突變后氨基酸側(cè)鏈伸向活性中心部位，距離僅有2.80(A)和3.68(A)。推測這影響大分子抑制劑與活性中心絲氨酸殘基的結(jié)合，是mAChE1抑制劑敏感性降低的原因。
　　3.wace1和mace1轉(zhuǎn)基因細胞構(gòu)建
　　為了研究wace1與mace1在家蠶細胞中的表達特征及蛋白活性，本研究將wace1與m

7、ace1連接到轉(zhuǎn)基因載體pIZT/V5-His，轉(zhuǎn)入BmN細胞，通過篩選和鑒定得到轉(zhuǎn)基因細胞。經(jīng)過PCR和Western檢測，ace1在細胞中正常表達。測定了wace1和mace1轉(zhuǎn)基因細胞中ace1表達量，分別是對照的21.51倍和21.69倍。對轉(zhuǎn)基因細胞AChE活力的檢測顯示，wace1和mace1轉(zhuǎn)基因細胞AChE活力分別比對照組高10.62％和20.21％。用10-6 M毒扁豆堿和10-3 mg/mL辛硫磷分別與wace1和m

8、ace1轉(zhuǎn)基因細胞酶液孵育后，mAChE的剩余酶活力比wAChE分別高7.47％和17.41％。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入ace1可以顯著提高ace1的表達量，ace1特定位點的突變可以降低AChE對抑制劑的敏感性。
　　4.家蠶通用型基因打靶載體的構(gòu)建及應用
　　為了構(gòu)建適合在家蠶中使用的通用型基因打靶載體，方便實現(xiàn)家蠶的簡單基因敲除、條件基因敲除及基因敲入，打靶陽性個體的篩選。本研究以pBluescriptⅡ SK+為骨架，插入了一

9、個Actin3啟動子驅(qū)動的GFP報告基因和一個IE啟動子驅(qū)動的正向選擇標記基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，neo），并在其兩側(cè)各添加一個方向相同的FRT位點，以方便打靶成功后去除正向篩選標記基因，在GFP上游加入多克隆位點(multiple cloning site，MCS) MCSII，在MCSII和下游FRT兩側(cè)加入一個方向相同的LoxP以方便實現(xiàn)條件基因敲除，在兩個LoxP外側(cè)各加一個多克隆位點，加入一個attP以方便基因的敲入，加入

10、一個Actin3啟動子驅(qū)動的負選擇標記基因（單純皰疹病毒胸苷激酶基因，HSV-tk1），構(gòu)建家蠶通用型基因打靶載體(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)。
　　為了驗證基因打靶載體的可行性，本研究利用此載體對家蠶BmN細胞的ace1進行了敲除?？寺ce1的兩段序列到家蠶通用型基因打靶載體，分別做為上下游交換臂，轉(zhuǎn)染BmN細胞后，采用G418進行篩選，經(jīng)篩選后細胞可見綠色熒光，表明GFP和neo正常表達。通過P

11、CR鑒定，外源基因與基因組發(fā)生同源重組。結(jié)果表明構(gòu)建的家蠶通用型基因打靶載體可用于家蠶基因打靶。
　　5.mace1轉(zhuǎn)基因家蠶的制備
　　本研究將pIZT-mace1與脂質(zhì)體混合，用精子介導法進行轉(zhuǎn)基因，產(chǎn)下的蠶卵正常催青飼養(yǎng)至化蛹，記為G0代。利用體視熒光顯微鏡對綠色熒光蠶蛹進行篩選，取熒光蠶蛹，正?；瓴⒔慌洚a(chǎn)卵，催青飼養(yǎng)，記為G1代，并依次類推。提取G2代蠶蛾基因組，PCR鑒定GFP和轉(zhuǎn)入的mace1，結(jié)果檢測到GFP

12、和mace1，表明轉(zhuǎn)基因家蠶構(gòu)建成功。
　　本研究首次研究了突變對家蠶AChE1結(jié)構(gòu)和功能的影響，發(fā)現(xiàn)三個關(guān)鍵位點的突變，改變了AChE1的結(jié)構(gòu)，降低了其對抑制劑的敏感性;構(gòu)建了家蠶通用型基因打靶載體，利用此載體對家蠶ace1進行打靶;構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，并將mace1轉(zhuǎn)入家蠶。本研究闡明了家蠶AChE1三個位點的突變可以降低對抑制劑的敏感性，為研究AChE突變與抗藥性的關(guān)系提供新的思路;為家蠶基因敲除和轉(zhuǎn)基因提供素材;也為培育家蠶抗