PAP-M6P、RGDY對(duì)肝星狀細(xì)胞活化功能的聯(lián)合干預(yù).pdf

1、目的： 活化期肝星狀細(xì)胞（HSC）表面6-磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子II型受體（M6P/IGF II R）和整合素（integrin）受體顯著增加。本研究應(yīng)用人工合成的6-磷酸-α-D-對(duì)氨基苯基甘露糖苷（PAP-M6P）和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-酪氨酸（Arg-Gly-Asp-Tyr，RGDY）小肽，比較兩者單用對(duì)活化期HSC生物學(xué)特性的影響，并觀察兩者對(duì)HSC活化功能的聯(lián)合干預(yù)作用。 方 法： ①采用人工

2、合成含有RGD序列的RGDY肽，并通過化學(xué)方法對(duì)M6P進(jìn)行結(jié)構(gòu)變換，對(duì)位連接氨基苯基，而不影響原有活性功能基團(tuán)，合成帶有M6P基團(tuán)的靶向分子PAP-M6P。兩藥均經(jīng)核磁共振譜及高效液相鑒定分子結(jié)構(gòu)及純度。 ②體外分離、培養(yǎng)10天的HSC，分別以終濃度為25、50、100、200μg/ml的RGDY或者終濃度分別為50、200、500、800μg/ml的PAP-M6P干預(yù)48小時(shí)，采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測藥物對(duì)細(xì)胞毒性影響，酶聯(lián)

3、免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液I型膠原和活化的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）蛋白含量。 ③培養(yǎng)10天的活化期HSC，分別設(shè)空白對(duì)照組，RGDY對(duì)照組（100μg/ml），PAP-M6P低濃度組（50μg/ml），PAP-M6P中濃度組（200μg/ml），PAP-M6P高濃度組（500μg/ml），低濃度聯(lián)合組（RGDY 100μg/ml + PAP-M6P 50μg/ml），中濃度聯(lián)合組（RGDY 100μg/

4、ml + PAP-M6P 200μg/ml），高濃度聯(lián)合組（RGDY 100μg/ml + PAP-M6P 500μg/ml）進(jìn)行干預(yù)。采用MTT法檢測藥物對(duì)細(xì)胞活力影響，ELISA法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液活化的TGF-β1、I型膠原、透明質(zhì)酸蛋白含量。逆轉(zhuǎn)錄PCR法（RT-PCR）分析TGF-β1mRNA基因表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)。 結(jié) 果： ①人工合成的PAP－M6P及RGD

5、Y純度均在95％以上，達(dá)到合成要求。 ②體外培養(yǎng)10天的HSC充分自身活化。RGDY 200μg/ml組及PAP-M6P 800μg/ml組細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，RGDY 200μg/ml，PAP-M6P 500、800μg/ml組細(xì)胞培養(yǎng)上清液活化的TGF-β1蛋白含量顯著減少（P＜0.05）；RGDY 50、100、200μg/ml組以及PAP-M6P 500、800μg/ml組培養(yǎng)上清液I

6、型膠原水平顯著降低（P＜0.05）。 ③中、高濃度聯(lián)合組與各自相應(yīng)濃度單藥組比較，活化的TGF-β1蛋白含量及基因表達(dá)水平明顯減少（P＜0.05）；高濃度聯(lián)合組培養(yǎng)上清中I型膠原、透明質(zhì)酸水平較相應(yīng)濃度單藥組顯著降低（P＜0.05）；各濃度聯(lián)合組與單藥組比較，α-SMA蛋白表達(dá)含量均明顯減少（P＜0.05）。 結(jié) 論： ①成功合成含有M6P基團(tuán)的靶向載體分子PAP-M6P。 ②單獨(dú)應(yīng)用人工合成的PAP-M