基于硒納米顆粒的新型生物材料研制與表征方法研究.pdf

1、硒作為生命體中必需的微量元素，是體內(nèi)各種含硒蛋白或亞單位的活性中心，參與了眾多生命活動，對人體、動物和植物的健康生長均起了非常重要的作用。納米硒是一種具有生物活性的紅色單質(zhì)硒，相對于其他形式硒，具有高生物活性、高安全性、高免疫調(diào)節(jié)能力、高抗氧化性和低毒性等“四高一低”的優(yōu)點，由我國科學(xué)家首先進行了研制，并在保健品、動物飼料及植物調(diào)節(jié)劑等領(lǐng)域均得到了廣泛應(yīng)用。 高效簡便的生物分析與檢測技術(shù)在研究生物活動本質(zhì)中發(fā)揮著重要作用，例如目

2、前廣泛使用的流式細胞術(shù)和熒光標記技術(shù)提高了生物分析的直觀效果，為研究藥物藥理和細胞活動提供了大量可靠而有力的證據(jù)。所以，根據(jù)具體研究要求而不斷改進與建立新的生物檢測技術(shù)依然是生物分析領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。為此，我們采用離體細胞體系開展了電化學(xué)分析方法研究，研制了新型生物傳感器并應(yīng)用在細胞生物分析中，為快速、準確地篩選藥物和檢測細胞活性提供新的選擇。 本研究主要開展了三方面的工作，首先是對硒納米顆粒的制備方法進行改進，成功制備了性質(zhì)

3、穩(wěn)定的硒納米顆粒和殼寡糖-硒納米顆粒，分別研究了他們的生物活性；其次是基于硒納米顆粒的良好生物活性，研制了一種含有硒與抗腫瘤藥物的新型復(fù)合納米藥物制劑；最后以硒納米顆粒的生物活性為研究對象，建立和發(fā)展了兩種檢測生物活性的新方法。主要結(jié)果如下： 一、硒納米顆粒的制備及生物活性分析。在以殼聚糖為模板制備硒納米顆粒方法的基礎(chǔ)上改進，實驗以殼寡糖為模板，采用抗壞血酸還原亞硒酸鈉，成功制備了性質(zhì)穩(wěn)定的紅色硒納米顆粒，該方法省去了醋酸溶解殼

4、聚糖的步驟和避免了殘留醋酸的毒害作用。通過透射電鏡、紅外光譜儀、X射線衍射等手段對制備納米顆粒進行表征，發(fā)現(xiàn)制備的硒納米顆粒平均粒徑32nm，顆粒均勻、分散性好，硒以無定形態(tài)物理吸附在殼寡糖表面。將硒納米顆粒與肝癌細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硒在低濃度下促進了細胞的增殖，高濃度下對癌細胞有很好的抑制作用，硒納米顆粒的抑癌活性與濃度呈正相關(guān)。 二、熒光法-噻唑蘭法聯(lián)用檢測硒納米顆?？寡趸钚??；诹u自由基對熒光染料羅丹明B的猝滅作用，建立

5、了硒納米顆粒清除羥自由基能力的檢測方法，并結(jié)合噻唑蘭實驗對比研究了硒納米顆粒的抗氧化作用和生物活性。結(jié)果表明：建立的檢測硒納米顆粒清除自由基的熒光檢測方法簡便有效，并成功應(yīng)用于其它抗氧化劑的清除羥自由基能力的檢測；同時，研究證實在一定濃度范圍內(nèi)硒納米顆粒清除自由基能力與濃度成線性關(guān)系。與抗壞血酸和亞硒酸鈉比較，納米硒清除自由基的能力遠遠強于它們，表明納米硒具有優(yōu)越的抗氧化性能。利用熒光法與噻唑蘭法結(jié)合研究硒納米顆粒作用細胞生長的效果，驗

6、證了其生物活性符合Weinberg原理。 三、氟尿嘧啶—殼寡糖/硒納米微球的研制與抗腫瘤活性分析。通過乙?；鶎?—氟尿嘧啶與殼寡糖連接，硒納米粒子吸附在殼寡糖上的方法首次將硒納米顆粒與抗腫瘤藥物5—氟尿嘧啶同載在殼寡糖納米微球中，制備了含有5—氟尿嘧啶和納米硒的殼寡糖復(fù)合納米微球。該微球平均粒徑為433 nm，對5—氟尿嘧啶和硒均有緩釋作用。將該微球應(yīng)用于腫瘤細胞的抑制實驗中，發(fā)現(xiàn)復(fù)合納米微球中兩種活性分子對腫瘤細胞的抑制具有明

7、顯的協(xié)同作用，說明我們自主創(chuàng)制的新型復(fù)合納米藥物制劑增強了5—氟尿嘧啶的抗腫瘤效果。 四、硒納米顆粒抗腫瘤活性檢測的生物傳感器研制?；贏nnexinⅤ蛋白與早期凋亡細胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸特異結(jié)合的特點，應(yīng)用層層自組裝技術(shù)將AnnexinⅤ蛋白修飾在金電極表面，成功研制了用于檢測早期凋亡細胞的生物傳感器。通過應(yīng)用到自建的早期凋亡細胞模型的研究，發(fā)現(xiàn)該傳感器對早期凋亡細胞具有特異性識別，識別前后的電化學(xué)阻抗信號具有明顯變化，在3

8、7℃、5mM Ca2+濃度下與細胞共孵育1h，可線性檢測早期凋亡細胞。該新型傳感器的檢測效果得到了目前常用的流式細胞儀和熒光顯微鏡的研究結(jié)果驗證。將該傳感器成功應(yīng)用于了硒納米顆粒和氟尿嘧啶誘導(dǎo)的早期凋亡細胞的檢測，說明AnnexinⅤ修飾生物傳感器可用于硒納米顆粒等生物活性物質(zhì)的抗腫瘤活性研究，為大量篩選新的生物活性物質(zhì)提供簡便的分析方法。 五、殼寡糖—硒納米植物營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑的研制與應(yīng)用。通過改進硒化殼寡糖的制備方法，制備了新型的

9、殼寡糖—硒納米顆粒。通過透射電鏡、粒徑分析儀等方法表征，發(fā)現(xiàn)殼寡糖—硒納米顆粒平均粒徑為100nm左右，在酸性條件下，亞硒酸根與殼寡糖單元上活性羥基和氨基化合，形成殼寡糖—硒復(fù)合分子，剩余的基團與帶負電的多聚磷酸鈉復(fù)凝聚，在4℃下能夠穩(wěn)定保存，25℃以上殼寡糖溶脹而致納米顆粒發(fā)生分解。此外，我們以殼寡糖硒納米顆粒為主要原料研制了植物營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，考察了殼寡糖硒納米顆粒對水稻生長和籽粒富硒的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該植物營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑能促進水稻的生長，顯