基于光子晶體顆粒的新型生物傳感器的制備和表征.pdf

1、最近，光子晶體被深入研究且廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)以及生物等領(lǐng)域。光子晶體作為一類(lèi)重要的先進(jìn)光學(xué)材料，最重要的特征就是具有光子禁帶結(jié)構(gòu)，以及對(duì)光波的調(diào)制作用。利用這種特性，人們通過(guò)合成具有特殊功能的光子晶體材料，在光、熱、電場(chǎng)、磁場(chǎng)以及機(jī)械力等外界條件達(dá)到了對(duì)光子禁帶調(diào)制的作用。與此同時(shí)，光子禁帶的結(jié)構(gòu)受材料折射率的影響，而且還與晶格參數(shù)密不可分。就三維膠體光子晶體而言，其Bragg衍射峰位置與晶格常數(shù)成正比，因此任何引起材料整體折射率或是

2、晶格常數(shù)的改變都會(huì)引起光子禁帶位置的移動(dòng)。當(dāng)光子晶體中引入刺激響應(yīng)性的凝膠作為骨架時(shí)，其會(huì)受到外界條件如pH、溫度、電場(chǎng)等的變化而產(chǎn)生強(qiáng)烈的體積膨脹、收縮。值得一提的是，利用凝膠這種膨脹、收縮的性質(zhì)，結(jié)合光子晶體技術(shù)，人們就可以制備出以凝膠為材料的光子晶體，這種凝膠光子晶體可以對(duì)外界刺激產(chǎn)生響應(yīng)同時(shí)具有自表達(dá)的功能。由凝膠體積變化引起的結(jié)構(gòu)常數(shù)變化導(dǎo)致禁帶移動(dòng)很大，光學(xué)特性的變化往往能夠直接通過(guò)肉眼觀察到。這樣就可以將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為可讀

3、的光學(xué)信號(hào)，甚至是顏色變化。目前為止，以凝膠為骨架的光子晶體已廣泛用作各類(lèi)傳感器。據(jù)我們所知，鮮有報(bào)道將光子晶體應(yīng)用于生物活體成像的研究。因此，對(duì)core-shell結(jié)構(gòu)的凝膠納米微球用于組裝成三維響應(yīng)性的光子晶體顆粒的制備，以及用于生物活體成像的研究有待深入探討。
　　 本文主要圍繞響應(yīng)性的光子晶體顆粒的制備，pH響應(yīng)性的光子晶體顆粒用于Japanese medaka活體成像的研究，以及離子響應(yīng)性的光子晶體用于淡水medaka

4、和海水medaka體內(nèi)離子分布成像的研究。具體的研究成果如下所述:
　　 1、用于自組裝成光子晶體顆粒的單分散性聚合微球的制備
　　 我們通過(guò)沸騰無(wú)皂乳液聚合制備了三種具有不同表面性質(zhì)的微球:聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，以及以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球。TEM圖表明，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，與以聚苯乙烯/聚丙烯

5、酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球都是core-shell結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，我們用這三種類(lèi)型的微球制備出多分散性的光子晶體顆粒。SEM圖可以看出，光子晶體顆粒的單分散性很差，然而組裝成光子晶體顆粒的三種類(lèi)型的微球都是單分散的，而且是呈正六邊形規(guī)整堆積。通過(guò)比較上述三種不同表面性質(zhì)微球的尺寸可以發(fā)現(xiàn)，隨著組裝成光子晶體顆粒的微球尺寸的增加，光子晶體顆粒的反射光譜會(huì)發(fā)生紅移。同時(shí)，為了探

6、討用三種不同表面性質(zhì)的微球組裝成的光子晶體顆粒的pH響應(yīng)性，我們將光子晶體顆粒分別置于正十六烯和pH緩沖液中。通過(guò)反射光譜測(cè)試可知，由于在正十六烯和pH緩沖液中，其反射峰的位置基本上沒(méi)有改變，故可知聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，和毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球組裝成的光子晶體顆粒沒(méi)有pH響應(yīng)性。然而，以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在正十六烯和一些列

7、的pH緩沖液中呈現(xiàn)出明顯的顏色改變，隨著pH的升高，肉眼可見(jiàn)顏色從正十六烯的紫色轉(zhuǎn)變?yōu)閜H11時(shí)候的明亮的綠色，且光子晶體顆粒響應(yīng)的反射光譜會(huì)發(fā)生明顯的紅移從462nm移至560nm。
　　 為了驗(yàn)證光子晶體顆粒pH響應(yīng)的準(zhǔn)確性，我們于25°測(cè)試了聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，以及以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球在相應(yīng)pH下的動(dòng)態(tài)

8、直徑Dz。結(jié)果表明，聚苯乙烯/聚丙烯酸微球載pH3時(shí)候的動(dòng)態(tài)直徑Dz為209±2nm，當(dāng)pH為7時(shí)，其動(dòng)態(tài)直徑Dz基本上沒(méi)變?yōu)?08±3nm，故可知，當(dāng)聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面未經(jīng)修飾時(shí)候，其不具備pH響應(yīng)性。由此也可以解釋用聚苯乙烯/聚丙烯酸微球組裝成的光子晶體顆粒沒(méi)有pH響應(yīng)的原因:單純依靠聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面的羧基官能團(tuán)之間的排斥作用不足以改變微球之間堆積的間距。然而，當(dāng)在聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面接枝毛發(fā)型的聚丙烯酸的高

9、分子鏈后，該毛發(fā)型微球有很好的pH響應(yīng)性，其動(dòng)態(tài)直徑Dz從pH3時(shí)的245±1nm增加到pH11時(shí)的300±3。這是由于隨著pH的升高，聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面的聚丙烯酸鏈段中的丙烯酸官能團(tuán)去質(zhì)子化而使得聚丙烯酸鏈伸展，從而使得其動(dòng)態(tài)直徑Dz增加，反之亦然。但是當(dāng)pH升高到7以后，pH的增加僅僅使得體系鹽分的增高，故其動(dòng)態(tài)直徑Dz會(huì)呈現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象。盡管毛發(fā)型微球有著很好的pH響應(yīng)性，但是用其組裝成的光子晶體顆粒卻沒(méi)有pH響應(yīng)性，推

10、測(cè)其可能性有兩個(gè)方面:第一是由于毛發(fā)型的聚丙烯酸鏈段未交聯(lián)，故其僅僅擁有水凝膠與水的混合能，而不具備由于水凝膠交聯(lián)而擁有的彈性能，因此僅僅依靠混合能難以改變光子晶體顆粒中微球的間距;第二可能是由于毛發(fā)型的微球不是如我們理想狀態(tài)的毛發(fā)結(jié)構(gòu)，而這一機(jī)理將有待于在接下來(lái)工作中深入探討和驗(yàn)證。
　　 而以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球，由于在聚苯乙烯/聚丙烯酸微

11、球表面包裹上了一層交聯(lián)的聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠層，因此該微球有著很好的pH響應(yīng)性。其動(dòng)態(tài)直徑Dz從pH3時(shí)的210±3nm增加到pH11時(shí)的291±3nm，其pH響應(yīng)的機(jī)理與毛發(fā)型微球的機(jī)理一樣，但是與毛發(fā)型微球比較可以看到，其動(dòng)態(tài)直徑Dz隨著pH增加的改變趨勢(shì)要比毛發(fā)型的要舒緩得多，這是由于交聯(lián)水凝膠層使得其殼層具有一定的彈性效應(yīng)的緣故。更重要的是，core-shell凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒也有著同樣靈敏的pH響應(yīng)

12、效果，這是由于交聯(lián)的水凝膠殼層結(jié)構(gòu)使得這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)既具備由于水凝膠與水混合時(shí)候的混合能，同時(shí)也擁有由于交聯(lián)帶來(lái)的彈性能，使得光子晶體顆粒表面的凝膠微球在pH緩沖液中，隨著pH的改變使得水凝膠殼層的收縮或溶脹所帶來(lái)的凝膠微球間距的改變而導(dǎo)致Bragg衍射的改變，宏觀上體現(xiàn)為光子晶體顆粒顏色的改變。
　　 由此，讓我們受到啟發(fā)，通過(guò)引進(jìn)不同的水凝膠單體，可以得到不同響應(yīng)性的光子晶體顆粒;與此同時(shí)，由于微球表面修飾的是生物相容性的水凝

13、膠殼層結(jié)構(gòu)，和光子晶體顆粒隨外界環(huán)境改變時(shí)候肉眼可見(jiàn)的顏色改變，故啟發(fā)我們將其用于生物活體成像的研究。
　　 2、光子晶體顆粒用于活體成像分析Japanese medaka的腸胃形貌和pH狀況
　　 如前所述，我們利用沸騰無(wú)皂乳液聚合法制備了以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃郾┧?聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球，且已知道微球的大小對(duì)于組裝成光子晶體顆粒的Bragg衍射有很大影響:微球

14、尺寸增大會(huì)導(dǎo)致Bragg衍射紅移，而當(dāng)微球尺寸減小時(shí)，Bragg衍射會(huì)藍(lán)移。為了獲得較大的顏色跨度，所以我們利用實(shí)驗(yàn)中的配方來(lái)制備凝膠微球。與此同時(shí)，在種子共聚合過(guò)程中，我們通過(guò)改變單體丙烯酸，N-異丙基丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的量來(lái)控制殼層結(jié)構(gòu)的厚度和致密度。動(dòng)態(tài)直徑Dz的測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)增加單體丙烯酸和N-異丙基丙烯酰胺的含量時(shí)，凝膠微球的殼層會(huì)變厚，從而使得其溶脹度會(huì)增大;然而當(dāng)增加交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰

15、胺的量時(shí)，凝膠微球的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的剛性增強(qiáng)，使得其對(duì)pH的響應(yīng)變得溫和，但是當(dāng)在同一pH緩沖液中，增加交聯(lián)劑含量時(shí)凝膠微球的動(dòng)態(tài)直徑Dz卻比未增加交聯(lián)劑含量時(shí)要大。我們認(rèn)為這是由于沸騰無(wú)皂乳液聚合的溫度要遠(yuǎn)高于交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的LCST，所以可知N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺相對(duì)于丙烯酸而言較疏水，故我們推測(cè)交聯(lián)劑含量的增加使得丙烯酸均相聚合量大為減少，為了穩(wěn)定微球從而使得丙烯酸更多地參與到凝膠殼層的聚合中去了，從而導(dǎo)致凝膠微球

16、的殼層厚度增加，故使得其溶脹程度增加。
　　 當(dāng)pH緩沖液中未另外加入鹽分的時(shí)候，上述凝膠微球體現(xiàn)出很好的pH響應(yīng)性。為了證明，該凝膠微球是否在生理環(huán)境下仍然有著很好的pH響應(yīng)性，于是我們往一系列的pH緩沖液中都加入154mM的NaCl，該濃度與生物體內(nèi)的鹽分濃度相似。通過(guò)測(cè)試動(dòng)態(tài)直徑Dz可知，即便在生理鹽分濃度下，凝膠微球仍然體現(xiàn)出很好的pH響應(yīng)性。與未加鹽分且在同一pH值所測(cè)得的動(dòng)態(tài)直徑Dz相比，加入了154mM的凝膠微球動(dòng)

17、態(tài)直徑Dz要小，是由于鹽分濃度的增加使得Donna滲透壓降低而導(dǎo)致凝膠微球殼層收縮。
　　 我們的目標(biāo)是將上述凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在生理環(huán)境下成功應(yīng)用于Japanese medaka的活體成像研究，且能夠保證光子晶體顆粒在生物體內(nèi)仍然能夠有著很明顯的顏色改變，以及能夠保持結(jié)構(gòu)的完整性。為此，我們將上述凝膠微球組裝成光子晶體顆粒后于pH緩沖液中發(fā)現(xiàn)，在種子共聚合過(guò)程中，當(dāng)加入的單體含量較少時(shí)，由其所組裝成的光子晶體顆粒的p

18、H響應(yīng)的顏色跨度小，僅從pH3時(shí)候的紫色到pH11時(shí)候的藍(lán)綠色，且從Japanese medaka的活體成像圖難以分辨出其體內(nèi)pH的改變。然而，當(dāng)單體含量增加，交聯(lián)劑含量相對(duì)不變的情況下，由其所組裝成的光子晶體顆粒有著很好的pH響應(yīng)，而且有著很大的顏色跨度從pH3時(shí)候的紫色到pH11時(shí)候的明亮綠色，但是由于交聯(lián)劑含量未改變，從而使得光子晶體顆粒結(jié)構(gòu)易受破壞而導(dǎo)致Bragg衍射很弱:組裝成光子晶體顆粒的凝膠微球的殼層結(jié)構(gòu)在低交聯(lián)度時(shí)很柔軟

19、，容易過(guò)分溶脹而導(dǎo)致堆積結(jié)構(gòu)易受到破壞，Japanese medaka的活體成像圖亦證明了這一點(diǎn)。當(dāng)我們?cè)黾咏宦?lián)劑的含量時(shí)，既能夠使得凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒有著很大的顏色跨度，同時(shí)亦能夠保持很好的結(jié)構(gòu)完整性。
　　 在我們將pH響應(yīng)性的光子晶體顆粒喂給Japanese medaka吃前，我們先檢測(cè)了光子晶體顆粒在一系列未加有NaCl的pH緩沖液中，以及加有38.5mM，77mM和154mM的NaCl的pH緩沖液中的反射光譜

20、。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，隨著鹽分濃度的增加，光子晶體顆粒的pH響應(yīng)顏色改變跨度變窄，但是卻依然在pH3和pH9時(shí)顏色上有著明顯的區(qū)別，與此同時(shí)，光子晶體顆粒能夠在生理鹽分濃度下有著很好的pH響應(yīng)性。故此，我們將光子晶體顆粒喂給出生五天的Japanese medaka吃。24h后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，光子晶體顆粒在Japanese medaka體內(nèi)清晰可見(jiàn)，且未出現(xiàn)任何毒副作用。由于Japanese medaka在年幼時(shí)是透明的，且沒(méi)有胃，食道直接連接

21、到中腸段，故其主要的消化部位是在中腸段。由胰腺，腸壁，膽汁和肝臟分泌的消化酶主要用于食物中的蛋白，脂肪和糖類(lèi)的分解。對(duì)大部分teleostei而言，其消化酶作用的最佳pH值是堿性大約為pH7-9。Japanesemedaka活體成像圖表明，Japanese medaka的腸呈現(xiàn)環(huán)狀，且于中腸段，光子晶體顆粒呈現(xiàn)出明亮的綠色，然而位于后腸段，光子晶體顆粒呈現(xiàn)出藍(lán)色。故我們可以推測(cè)，Japanese medaka的中腸段pH值大約為8-9，

22、而后腸段pH值大約為4-5，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　 由此，我們利用pH響應(yīng)性的光子晶體顆粒成功地實(shí)現(xiàn)了Japanese medaka活體成像研究，且了解到其體內(nèi)的形貌和微觀pH環(huán)境，這不僅為光子晶體顆粒的應(yīng)用開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域，與此同時(shí)亦是對(duì)生物學(xué)、解剖學(xué)提供了一種全新的探究生物體微觀環(huán)境的方法。
　　 3、無(wú)毒光子晶體顆粒用于活體成像分析淡水和海水medaka的腸胃形貌和離子濃度狀況
　　 我們利用pH響應(yīng)

23、性的光子晶體顆粒成功地實(shí)現(xiàn)了Japanese medaka活體成像研究，且了解到其體內(nèi)的形貌和微觀pH環(huán)境，與此同時(shí)，我們想更深入探索medaka體內(nèi)的鹽分濃度，以及淡水和海水medaka的區(qū)別。
　　 與前部分一樣，我們利用沸騰無(wú)皂乳液聚合制備了以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球?yàn)楹撕鸵跃奂谆┧崃u乙酯/聚對(duì)苯乙烯磺酸鈉為殼層的凝膠微球。在種子共聚合過(guò)程中，通過(guò)改變交聯(lián)劑的含量來(lái)進(jìn)行對(duì)比得到凝膠微球動(dòng)態(tài)直徑Dz的差別。動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)得

24、的Dz表明，由于對(duì)苯乙烯磺酸鈉的含量較低，而且是很強(qiáng)的電解質(zhì)，在聚合過(guò)程中，單獨(dú)改變交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度對(duì)凝膠微球的表面性質(zhì)改變不大。故不同交聯(lián)劑濃度聚合所得到的凝膠微球的Dz在0-500mM的NaCl溶液中變化趨勢(shì)相似，而且是僅受離子濃度的影響而不會(huì)受pH影響。
　　 由上述兩種不同交聯(lián)劑濃度聚合所得到的凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在0-500mM的NaCl溶液中的顏色改變也基本上一樣，由0mM的NaCl時(shí)的

25、明亮的綠色轉(zhuǎn)變?yōu)?00mM的NaCl時(shí)的紫色，這是由于兩種凝膠微球的溶脹度接近從而使得Bragg衍射差異較小。從反射光譜圖可以看出，光子晶體顆粒的Bragg衍射隨著離子濃度增加而藍(lán)移，而且顏色轉(zhuǎn)變明顯，在NaCl的濃度為50mM時(shí)出現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。
　　 眾所周知，淡水medaka生存在一個(gè)高滲透的環(huán)境中，因此體內(nèi)離子依靠擴(kuò)散來(lái)排出體外，而水通過(guò)滲透進(jìn)入體內(nèi)。為了維持體內(nèi)鹽分和水分的均衡，故淡水medaka通過(guò)腮來(lái)吸收離子，而體內(nèi)

26、過(guò)多的水分以尿液的形式排除體外。周?chē)乃畷?huì)隨著食物一起進(jìn)入淡水medaka的消化道內(nèi)，而腸就是medaka一個(gè)很重要的消化組織，因?yàn)殡x子的吸收也在這個(gè)部位進(jìn)行。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，淡水medaka中腸段的離子濃度要比后腸段的離子濃度要低，是由于該腸段的Na+-和K+-ATPases的濃度比后腸段的要高。這與我們用單獨(dú)離子響應(yīng)的光子晶體顆粒驗(yàn)證的結(jié)果相符，從淡水medaka的顯微鏡圖片我們可以看到，在medaka的中腸段，光子晶體顯示出明亮的綠色

27、，我們推測(cè)該段的離子濃度應(yīng)該小于50mM，而后腸段中光子晶體顯示出藍(lán)色，故我們推測(cè)該段的離子濃度應(yīng)該大于50mM。
　　 然而，海水medaka卻與淡水medaka生存環(huán)境恰恰相反，海水medaka周邊是一個(gè)低滲透的環(huán)境，水分是依靠腮表面擴(kuò)散來(lái)排除體外，而大量的鹽分卻被攝入到體內(nèi)，所以很多海水魚(yú)的腎小球都很小甚至有的魚(yú)腎小球都退化了以減少水分的排除。海水medaka為了維持體內(nèi)水分的均衡，所以需要大口大口地喝水。大約60-85％

28、的海水在海水medaka的腸段吸收，同時(shí)伴隨著水分和離子的吸收。通過(guò)離子響應(yīng)性的光子晶體活體成像圖我們可以看到，從海水medaka的中腸段到后腸段，光子晶體的顏色都一樣都是藍(lán)色，由此可知海水medaka體內(nèi)鹽分的濃度大于50mM，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符。
　　 結(jié)果表明，利用生物相容性和單獨(dú)離子響應(yīng)性的光子晶體顆粒可以成功反映出淡水medaka和海水medaka體內(nèi)鹽分梯度，同時(shí)也揭示出兩種medaka體內(nèi)鹽分的差異是由于其生活