新的胃癌相關(guān)腫瘤抑制因子CXXC4的表觀遺傳調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:胃癌是最常見(jiàn)的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。除了遺傳學(xué)的改變外，表觀遺傳調(diào)控紊亂在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也日益受到關(guān)注，可導(dǎo)致許多致瘤信號(hào)通路的異常激活。作為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要成員之一，EZH2在多種腫瘤中均呈高表達(dá)狀態(tài)，但其在胃癌中導(dǎo)致致瘤信號(hào)異常激活的機(jī)制仍不清楚。
　　目的:目前已有研究證實(shí)CXXC4在腎細(xì)胞癌中是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控因子，但其具體分子作用機(jī)

2、制和生物學(xué)功能尚未明確。我們希望通過(guò)一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)明確CXXC4基因的生物學(xué)功能及抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制。具體來(lái)說(shuō)，我們想知道CXXC4是否在胃癌中也參與對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控。本研究中將首次提出CXXC4是EZH2下游的一個(gè)直接靶基因;證實(shí)CXXC4是一個(gè)新的胃癌相關(guān)腫瘤抑制因子;闡明EZH2可通過(guò)抑制CXXC4的表達(dá)來(lái)激活Wnt和MAPK等致瘤信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　方法:首先我們?cè)谖赴┘?xì)胞系中利

3、用EZH2 siRNA處理前后基因表達(dá)的微陣列分析篩選了一系列EZH2下游的靶基因，并通過(guò)qPCR驗(yàn)證，最終選定CXXC4基因做進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)受到EZH2的顯著抑制。接下來(lái)我們運(yùn)用ChIP(ChromatinImmunoprecipitation)實(shí)驗(yàn)以明確EZH2對(duì)CXXC4的表達(dá)調(diào)控是直接作用還是間接作用。通過(guò)免疫組化和mRNA原位雜交技術(shù)檢測(cè)EZH2和CXC4在組織水平上表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建CXXC4的真核表達(dá)載體(pCMV

4、-3Tag7-CXXC4)和CXXC4shRNA(pSUPERi-CXXC4)，觀察外源性CXXC4對(duì)細(xì)胞表型的影響，如運(yùn)用MTS和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力等。構(gòu)建Doxcycline誘導(dǎo)CXXC4穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株和CXXC4穩(wěn)定敲除細(xì)胞株，建立裸鼠成瘤模型以進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)CXXC4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。構(gòu)建CXXC4與其相互作用蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)突變體，運(yùn)用免疫共沉淀(Co IP)，Western Blot和ELISA等方法闡明C

5、XXC4抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳機(jī)制。
　　結(jié)果:本研究中首次證實(shí)CXXC4是受到EZH2直接調(diào)控的一個(gè)新的靶基因。EZH2通過(guò)直接結(jié)合CXXC4基因的啟動(dòng)子區(qū)域抑制其轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制其表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)CXXC4能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);同時(shí)，與正常胃粘膜上皮細(xì)胞和正常胃組織相比，CXXC4在胃癌細(xì)胞和原發(fā)胃癌組織中均呈低表達(dá)狀態(tài)，CXXC4的表達(dá)下調(diào)降低了早期胃癌患者的生存預(yù)后(p＜0.05)。因此，首次提出CXXC4是一個(gè)

6、新的腫瘤抑制因子。機(jī)制上，CXXC4通過(guò)失活Wnt和MAPK信號(hào)通路抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CXXC4的敲除（siRNA or shRNA）可激活Wnt和MAPK信號(hào)通路并促進(jìn)細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)。CXXC4通過(guò)穩(wěn)定β-catenin降解復(fù)合物(β-catenindestruction complex)的完整性來(lái)抑制wnt信號(hào)通路，并通過(guò)破壞Erk1/2與MEK1/2之間的相互作用抑制MAPK的激活。最后，EZH2促進(jìn)Wnt和MAPK信號(hào)

7、通路的激活可被過(guò)表達(dá)的CXXC4所抑制，而CXXC4的敲除逆轉(zhuǎn)了EZH2 siRNA介導(dǎo)的對(duì)wnt和MAPK通路的抑制作用。
　　結(jié)論:CXXC4是受到EZH2直接調(diào)控的一個(gè)新的胃癌相關(guān)腫瘤抑制因子，其表達(dá)水平是早期胃癌患者的一個(gè)重要預(yù)后因素。EZH2可通過(guò)下調(diào)CXXC4的表達(dá)激活Wnt和MAPK信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.CXXC4是一個(gè)新的胃癌相關(guān)腫瘤抑制因子。
　　2.CXXC4

8、是EZH2下游的一個(gè)新的直接靶基因。
　　3.CXXC4的表達(dá)是早期胃癌患者的一個(gè)重要預(yù)后因素。
　　4.CXXC4通過(guò)穩(wěn)定β-catenin降解復(fù)合物的完整性抑制Wnt信號(hào)通路的激活。CXXC4的C末端的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)K161和T162對(duì)其與Dvl的相互作用及β-catenin的降解至關(guān)重要。
　　5.CXXC4通過(guò)直接結(jié)合ErK1/2及破壞Erk1/2與MEK1/2之間的相互作用抑制MAPK信號(hào)通路。