ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因及其表遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，在男性中其死亡率居癌癥死因的第二位，而在女性中其死亡率居癌癥死因第三位。我國胃癌發(fā)病率居各類腫瘤的首位，約42％的胃癌病人出現(xiàn)在我國。大部分病人診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，預(yù)后不良。因此，需要對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　近年來，越來越多的證據(jù)證實(shí)表遺傳學(xué)的改變?cè)谖赴┑陌l(fā)生、發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。這些表遺傳學(xué)包括組蛋白修飾、DNA甲基化是不依賴基因

2、的突變和缺失而導(dǎo)致基因失活的重要機(jī)制。胃癌相關(guān)抑制基因的失活往往伴隨著異常的組蛋白修飾、DNA甲基化。其中，組蛋白修飾被稱為“組蛋白密碼”可以影響染色體的結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的形成中起到很關(guān)鍵的作用。組蛋白賴氨酸的甲基化和乙酰化是兩種研究最為透徹的組蛋白修飾方式，被認(rèn)為參與多種分子生物過程的調(diào)控，如基因的激活和失活，X-染色體的活化，DNA的修復(fù)以及細(xì)胞周期的調(diào)控等。其中，高水平的H3K9乙酰化和H3K4三甲基化被認(rèn)為可以激活基因轉(zhuǎn)

3、錄，而高水平的H3K9三甲基被認(rèn)為與基因的失活相關(guān)。
　　在后基因時(shí)代，高通量技術(shù)的出現(xiàn)使在基因組水平上對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析成為可能。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合芯片(ChIP-chip)已經(jīng)被廣泛用于基因組水平腫瘤的研究。在本項(xiàng)研究中，我們利用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌中的抑制基因并對(duì)其表遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制及抑癌基因功能進(jìn)行了深入的研究。
　　目的：
　　本研究旨在利用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因，闡明其表遺傳學(xué)改

4、變情況，并且利用表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物進(jìn)行干預(yù)，探討其表遺傳學(xué)調(diào)控的機(jī)制。(1)采用Roche-NimbleGen的Human3×720K RefSeq Promoter Array篩選H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2的基因及H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2的基因。并選取4個(gè)候選基因利用ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ChIP-chip結(jié)果。(2)分析3個(gè)候選基因在胃癌細(xì)胞中的mRNA表

5、達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)研究胃癌細(xì)胞株在表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物的干預(yù)下3個(gè)候選基因的表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)，由此探討表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物在治療胃癌的臨床應(yīng)用價(jià)值。(3)通過體外構(gòu)建3個(gè)候選基因之一的PSD基因表達(dá)降低的胃癌細(xì)胞株，觀察對(duì)其增殖和侵襲能力的影響，進(jìn)一步論證其抑癌基因功能及作用機(jī)制。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　2009年4月～2010年6月中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所行根治性手術(shù)治療的胃癌

6、患者癌和癌旁配對(duì)組織共40例;人胃癌細(xì)胞株SGC7901、MKN45、 BGC823、AGS和永生化正常人胃細(xì)胞株GES1。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):GES1、SGC7901、MKN45、BGC823和AGS按常規(guī)培養(yǎng)。DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza-2-deoxycytidine)和/或組蛋白去乙?；敢种?TrichostatinA)對(duì)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行藥物干預(yù)及siRNA。
　　2、ChIP-chip技

7、術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因。
　　3、ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芯片篩選基因結(jié)果的可靠性。
　　4、MSP法檢測(cè)相關(guān)抑制基因啟動(dòng)子DNA甲基化狀況。
　　5、qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)抑制基因mRNA在細(xì)胞和組織水平的表達(dá)。
　　6、CCK-8法檢測(cè)藥物干預(yù)及siRNA前后胃癌細(xì)胞增值力的變化。
　　7、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物干預(yù)及siRNA前后胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。
　　8

8、、Western blot檢測(cè)胃癌旁和癌組織中PSD蛋白表達(dá)含量。
　　結(jié)果：
　　第一部分應(yīng)用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因的研究
　　ChIP-chip結(jié)果顯示134個(gè)基因的H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2以及46個(gè)基因的H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2。4個(gè)篩選基因進(jìn)行ChIP-qPCR檢測(cè)，結(jié)果與芯片分析結(jié)果相一致。
　　第二部分胃癌細(xì)

9、胞中篩選基因PSD、SMARCC1及Vps37A的表達(dá)及其表遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制
　　1、qRT-PCR結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞中的篩選基因PSD、SMARCC1表達(dá)水平均低于胃正常粘膜上皮細(xì)胞。然而，篩選基因Vps37A表達(dá)水平在胃癌細(xì)胞與胃正常粘膜上皮細(xì)胞之間沒有顯著差異。
　　2、MSP結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞中的PSD基因DNA啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)為甲基化，SMARCC1基因表現(xiàn)為部分甲基化。然而，Vps37A基因表達(dá)為非甲基化。

10、　　3、表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物（5-Aza-2-deoxycytidine、Trichostatin A）對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45細(xì)胞的增殖、遷徙及侵襲能力有明顯影響。并且可以逆轉(zhuǎn)PSD、SMARCC1基因DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，從而恢復(fù)PSD、SMARCC1基因mRNA的表達(dá)。但對(duì)Vps37A基因mRNA的的表達(dá)無明顯影響。
　　第三部分 PSD基因抑癌作用機(jī)制的探討以及其臨床意義
　　1、胃癌細(xì)胞中PSD基因表達(dá)水平明顯低

11、于GES1細(xì)胞，DNA甲基化及異常組蛋白修飾共同調(diào)控PSD基因表達(dá)。
　　2、篩選PSD相對(duì)高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株SGC7901采用siRNA技術(shù)下調(diào)其表達(dá)后，胃癌細(xì)胞株SGC7901的增殖力、侵襲力均明顯增強(qiáng)。
　　3、下調(diào)PSD基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞增殖、遷徙及侵襲能力明顯提高。
　　4、檢測(cè)篩選基因調(diào)控的細(xì)胞因子（Caspase3、Caspase7）的蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染后明顯下調(diào)。
　　5、胃

12、癌組織中PSD基因mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與其他臨床病理學(xué)特征具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、啟動(dòng)子芯片結(jié)合芯片技術(shù)(ChIP-chip)可以高通量的篩選胃癌中受表遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控的抑癌基因。
　　2、在胃癌細(xì)胞中，抑癌基因PSD、SMARCC1的表達(dá)下調(diào)是組蛋白修飾和DNA甲基化共同作用的結(jié)果。
　　3、PSD基因在胃癌中起到抑癌基因功能，其作用機(jī)制可能與誘