LF基因在鼻咽癌細胞系中遺傳學和表遺傳學改變及其功能糾正的初步研究.pdf

1、本研究在前期工作的基礎上，進一步分析了 LF 基因在鼻咽癌細胞系中的表達、遺傳學和表遺傳學改變。通過基因轉(zhuǎn)染實驗恢復鼻咽癌細胞系5-8F中LF基因的表達，并觀察LF基因恢復表達后對5-8F細胞生物學特性的影響，明確 LF 基因在5-8F細胞中的作用，為LF基因與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展相關性提供初步實驗證據(jù)。實驗方法和結(jié)果如下： 第一部分鼻咽癌細胞系中LF基因表達及遺傳學和表遺傳學改變。 采用RT-PCR、Real-time RT

2、-PCR方法檢測LF基因在8例慢性鼻咽炎組織和7株鼻咽癌細胞(HNE1、HNE2、HNE3、CNE1、CNE2、5-8F、6-10B)中的表達，結(jié)果顯示LF基因在慢性鼻咽炎組織中穩(wěn)定表達，在所有鼻咽癌細胞系中表達缺失或下調(diào)(P=0.001)。為了進一步闡明LF基因在鼻咽癌細胞系中表達失活的分子機制，從遺傳學 (LOH、基因突變)和表遺傳學(基因啟動子區(qū)甲基化)兩方面進行了分析。通過PCR-SSCP和測序方法分析了LF 基因啟動子區(qū)、第1

3、外顯子和第2外顯子的突變情況。在7種鼻咽癌細胞系中，僅檢測到在HNEl細胞系存在LF基因啟動子區(qū)突變(1076delC)，而在其他位點和細胞系中未發(fā)現(xiàn)突變，即LF基因在鼻咽癌細胞系中的突變檢測率為14％(1/7)，推測該突變可能通過影響 LF 基因啟動子與反式作用因子的結(jié)合，導致LF基因的表達失活。此外，結(jié)果也證實了LF基因的第二外顯子存在多態(tài)性。 采用PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳．銀染方法，對7種鼻咽癌細胞系中微衛(wèi)星位點(D

4、3S4169、GBD：181215、D3S1478、G59627和RH119558)的雜合性缺失情況進行了檢測，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)CNE1細胞系在D3S1478位點存在LOH，其余細胞系及其它位點未發(fā)現(xiàn)LOH，即LF基因在鼻咽癌細胞系中的的LOH檢測率為14％(117)，提示微衛(wèi)星位點的雜合性丟失可能對 LF 在鼻咽癌細胞中表達下調(diào)起了一定的作用。 為了探討LF基因啟動子區(qū)甲基化與鼻咽癌細胞系中LF基因的表達缺失或下調(diào)之間是否存在關系，

5、采用了甲基化特異性PCR方法檢測了7種鼻咽癌細胞系中 LF 基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況。結(jié)果顯示所有鼻咽癌細胞系中LF基因啟動子區(qū)均存在甲基化，其中CNE2和5-8F細胞中 LF 基因啟動子區(qū)存在不完全甲基化。這些結(jié)果說明啟動子區(qū)高甲基化可能是鼻咽癌細胞系中 LF 基因表達失活的主要原因。 第二部分鼻咽癌候選抑瘤基因 LF 功能的初步研究。 采用RT-PCR方法從慢性鼻咽炎組織中克隆 LF 基因的開放閱讀框序列，測序

6、結(jié)果顯示該序列存在2個SNP位點和一個突變位點(9523A→T)。將LF基因的開放閱讀框序列克隆到 pcDNA3.1(-)載體中，構(gòu)建了LF基因的真核表達載體(pcLF)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將peLF導入5-8F細胞，G418篩選獲得抗性克隆，進一步采用RT-PCR 檢測LF基因的mRNA表達，采用 Western Blotting檢測LF蛋白的表達，結(jié)果表明已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcLF的5-8F細胞系 (5-8F-LF)。免疫細胞化學

7、實驗顯示表達的LF蛋白主要定位于胞漿。隨后檢測了 LF 基因穩(wěn)定表達后對5-8F細胞的生物學特性的影響。 流式細胞分析結(jié)果表明，與對照組相比轉(zhuǎn)染pcLF后可以使5-8F-LF細胞停滯于G<,1>期，G<,1>期細胞比例增加(62．28％vs 51．81％)，S期(24．54％vs 27．80％)和G<,2>-M期細胞比例減少(13．19％vs20.38％)。 利用MTT法和平板克隆形成實驗觀察LF基因穩(wěn)定表達后對5-8F

8、細胞增殖能力和克隆形成能力的影響。MTT的結(jié)果表明5-8F-LF細胞的增殖速度明顯低于對照組 (P<0．05)；平板克隆形成實驗結(jié)果顯示5-8F-LF細胞的克隆形成率明顯低于對照組(28％ vs 54．7％)。提示 LF 基因穩(wěn)定表達后導致5-8F細胞的增殖能力和克隆形成能力降低。 本實驗在前期工作的基礎上，檢測了LF基因在慢性鼻咽炎和鼻咽癌細胞系中的表達差異并分析了導致表達差異的可能機制，結(jié)果提示 LF 基因在鼻咽癌細胞中表達