CHIP降解tau蛋白特性研究.pdf

1、第一部分 CHIP降解tau蛋白特性研究 神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)是阿爾茨海默病典型的腦病理特征之一，構(gòu)成NFTs的主要成分是異常磷酸化的tau蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)：CHIP(carboxylterminusofHsc70-interactingprotein)是tau蛋白特異性的泛素連接酶3。在體外，CHIP可以促進(jìn)tau蛋白的降解。但在體CHIP降解tau蛋白的特性還不清楚。另外，CHIP介導(dǎo)tau蛋白泛素化的方式目

2、前還存在爭(zhēng)議。在我們的研究中，用立體定位注射技術(shù)將CHIP質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠雙側(cè)海馬來(lái)研究CHIP對(duì)tau蛋白的降解特性。在CHIP質(zhì)粒注射后，在24小時(shí)內(nèi)CHIPmRNA和蛋白表達(dá)水平都呈時(shí)間依賴(lài)性的顯著升高。同時(shí)，CHIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠腦中總tau蛋白以及在PHF-1位點(diǎn)磷酸化和在tau-1位點(diǎn)非磷酸化的tau蛋白水平均顯著下降，且這種下降和CHIP的增加負(fù)相關(guān)。CHIP蛋白表達(dá)增加并不影響tau蛋白的mRNA水平和蛋白酶小體的活性。以上結(jié)果

3、提示在正常大鼠腦內(nèi)CHIP可以調(diào)節(jié)tau蛋白的降解且不依賴(lài)與tau蛋白的磷酸化狀態(tài)。我們進(jìn)一步檢測(cè)CHIP能否降解異常磷酸化的tau蛋白。通過(guò)側(cè)腦室注射wortmannin和GFX來(lái)復(fù)制tau蛋白磷酸化的動(dòng)物模型。我們發(fā)現(xiàn)和模型組相比，在CHIP過(guò)表達(dá)的鼠腦內(nèi)，在PHF-1位點(diǎn)過(guò)度磷酸化的tau蛋白水平顯著下降，而CHIP并不抑制wortmannin/GFX誘導(dǎo)的GSK-3β的激活。以上結(jié)果提示：在鼠腦內(nèi)CHIP過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)異常磷酸

4、化tau蛋白的降解。用激酶GSK3β的激活劑wortmannin或酯酶抑制劑崗田酸(OA)處理N2a細(xì)胞以誘導(dǎo)AD樣tau蛋白磷酸化的細(xì)胞模型，同時(shí)在N2a細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHIP質(zhì)粒，免疫熒光結(jié)果顯示過(guò)量表達(dá)CHIP可以降低tau蛋白在pS214和pS396位點(diǎn)的磷酸化水平并顯著抑制磷酸化tau蛋白的聚積。以上結(jié)果提示過(guò)量表達(dá)CHIP可以促進(jìn)異常磷酸化tau蛋白的降解。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)tau蛋白、Hsc70和CHIP二聚體共存。為確定在CH

5、IP和tau蛋白的相互作用中是否需要Hsc70，我們首先將大鼠海馬勻漿液用結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用Hsc70抗體進(jìn)行免疫沉淀去除Hsc70后，再用tau蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀仍然可以觀察到tau蛋白和CHIP二聚體復(fù)合物。以上結(jié)果提示在沒(méi)有Hsc70的情況下，CHIP二聚體仍可和tau蛋白直接相互作用。CHIP二聚體可能通過(guò)一種新的非Hsc70依賴(lài)的方式來(lái)發(fā)揮其作用。氯化鋰可以在細(xì)胞水平上調(diào)CHIP蛋白的表達(dá)?？傊覀兊慕Y(jié)果首次提供在體證據(jù)：二聚

6、體CHIP在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)tau蛋白的降解都是很關(guān)鍵的，二聚體CHIP可能通過(guò)非Hsc70依賴(lài)性的方式發(fā)揮作用。過(guò)表達(dá)CHIP可能是抑制NFTs形成的潛在治療手段之一。 第二部分一氧化氮通過(guò)激活GSK-3β誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化 AD病人腦內(nèi)的典型病理特征之一是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)，其主要是由異常磷酸化的tau蛋白組成。在NFTs中，可檢測(cè)到一氧化氮(Nitricoxide，NO)的存在。但是NO與tau蛋白磷酸

7、化的關(guān)系尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)：由廣泛應(yīng)用的NO的供體硝普鈉(odiumnitroprusside，SNP)產(chǎn)生的NO，在HEK293/tau441細(xì)胞中可以誘導(dǎo)tau蛋白在Ser396/404andSer262位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，同時(shí)可檢測(cè)到糖原合酶激酶(glycogensynthasekinase-3β，.GSK-3β)的激活。在SNP處理細(xì)胞前用GSK-3的抑制劑10mM的氯化鋰(lithiumchlorideLiCl)預(yù)處理1個(gè)小

8、時(shí)，則可以抑制由SNP誘導(dǎo)的tau蛋白的磷酸化改變和GSK-3β的激活。本實(shí)驗(yàn)首次證明在體外NO可以誘導(dǎo)AD樣tau蛋白磷酸化，GSK-3β的激活是NO誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化的機(jī)制之一。NO可能是在AD病人腦內(nèi)導(dǎo)致tau蛋白磷酸化的上游因子。 第三部分 大鼠皮質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的優(yōu)化 目的優(yōu)化大鼠皮質(zhì)雙向電泳樣品制備方法，初步建立雙向電泳條件，提高電分辨率和重復(fù)性。方法分別應(yīng)用三氯乙酸/丙酮沉淀法、超速離心法及