Ⅰ四川水稻立枯絲核菌的遺傳分化與致病力研究;Ⅱ水稻立枯絲核菌G蛋白β亞基基因的克隆、表達與序列分析.pdf

1、水稻立枯絲核菌(R.solani)是絲核菌屬(Rhizoctonia)的一個種，為半知菌亞門真菌，其分布廣、寄主范圍大，不產(chǎn)生無性孢子，常以菌核形態(tài)習居土壤，是玉米、水稻、草坪草、馬鈴薯等農(nóng)作物和紋枯病的致病菌。根據(jù)菌絲融合與否，立枯絲核菌可劃分為14個融合群(AG.1-AG-13和AG-BI)。1987年，Ogoshi等根據(jù)培養(yǎng)性狀、寄主以及生理生化等特性分成不同的種內(nèi)類群(Intraspecificgroup,ISG)，其中的一個融

2、合群AG-1劃分AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三個亞群。立枯絲核菌的AG-1IA亞群是水稻和玉米紋枯病的優(yōu)勢致病菌群，紋枯病在我國長江流域高溫、高濕條件下年年發(fā)生，是水稻和玉米等農(nóng)作物年年減產(chǎn)的主要因素之～。在四川，立枯絲核菌也造成水稻、玉米嚴重減產(chǎn)。因此，充分認識我省水稻立枯絲核菌(R-solani)生理小種變化的特點，進行綜合防治立枯絲核菌，提高抗病育種水平顯得尤其重要。 G蛋白是膜協(xié)同、異三聚體蛋白，由α、β、γ

3、3個亞單位組成。G蛋白及其受體(GPCRs)組成了真核生物細胞里最流行的信號系統(tǒng)、感官多樣調(diào)節(jié)系統(tǒng)、細胞生長和激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)。G蛋白β亞基呈現(xiàn)出一種桶形β折疊結(jié)構(gòu)，并包含WD40重復序列，其前端具有N端α螺旋，是G蛋白功能GTP連接轉(zhuǎn)換器。Gilman等研究表明，在真核生物中G蛋白β亞基基因參與信號傳導途徑，導致基因表達、細胞功能受到影響。在很多能對植物致病的病原真菌，如Dictyosteliumdiscoideum、Ustilagoma

4、ydis和Fusariumoxysporum中，G蛋白在整個代謝生長過程中都起著舉足輕重的作用，涉及細胞生長、分化和毒性等。Kasahara等對Cryphonectriaparasitica的研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白β亞基基因功能喪失轉(zhuǎn)基因菌株的菌絲缺乏明顯分叉，對植物侵染和致病力明顯降低。 本研究從四川不同生態(tài)區(qū)分離到水稻立枯絲核致病菌55株，研究其遺傳分化、致病力分化和聚類分析，并利用同源克隆方法分離水稻立枯絲核菌G蛋白β亞基基因，

5、對其功能做了些初步的研究，為研究水稻立枯絲核菌致病機理和對應(yīng)防治方法奠定基礎(chǔ)。實驗主要結(jié)果如下： 1.通過水瓊脂分離法共得到水稻立枯絲核菌菌株55株。 2.水稻立枯絲核菌菌絲融合：所有分離全部菌株中除D42都與標準菌株AG-1IA發(fā)生菌絲融合。部分菌株不僅僅能與其中的一種標準菌株發(fā)生菌絲融合，而且還能同時與其它一種或者多種標準菌株發(fā)生菌絲融合，這說明在細胞學水平上，這些立枯絲核菌具有多個菌群歸屬性，因此這類立枯絲核菌為橋

6、梁菌群。 3.水稻立枯絲核菌致病力鑒定：室內(nèi)采用離體葉片接種法，分別接種X400、蜀恢527R、蜀恢881R。結(jié)果表明，各菌株間致病力差異顯著。田間采用始穗期嵌入接種法，結(jié)果表明，各菌株間致病力差異顯著。同時發(fā)現(xiàn)，相同菌株同時接種三種材料時，室內(nèi)離體鑒定方法的致病力對不同材料差異較小，而活體接種方法表現(xiàn)出很大的材料間差異。 4.RAPD分子標記聚類分析：結(jié)果顯示，在相似系數(shù)0.91處，除D42、D54以外的所有分離菌株與

7、AG-1IA可聚為一類，而外群對照菌株A-1和另外9個國際標準菌株分別歸屬一類。以相似系數(shù)0.941為標準，可以把55個水稻立枯絲核菌菌株為8類：D1、D35、D6等40個為第1類；D36、D39、D40、D46、D41為第2類；D7和D20第3類；D37和D50為第4類；D2和D3為第5類；D47和D55為第6類；D42為第7類；D54為第8類。 5.水稻立枯絲核菌G蛋白β亞基基因的同源克?。豪醚苌訲.cucumerisG

8、蛋白β亞基基因序列的特異引物，對水稻立枯絲核菌菌株DNA進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可以觀察到一條約1.9kb大小的擴增帶，與預期的G蛋白β亞基基因大小相吻合。經(jīng)測序表明該片段為水稻立枯絲核菌G蛋白β亞基基因的擴增產(chǎn)物。softberry軟件分析證實，該序列包含一個約1.7kb的完整開放閱讀框，編碼366個氨基酸。 6.G蛋白beta亞基基因多態(tài)性及進化分析：對11個水稻立枯絲核菌菌株的G蛋白β亞基基因氨基酸序列作

9、同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，他們之間同源性較高，但是，在某些區(qū)間發(fā)生變異。進化分析發(fā)現(xiàn)該序列與大量物種G蛋白β亞基基因明顯同源，一致性介于88.14-57.34％。 7.基因的表達模式分析：通過半定量RT-PCR法對水稻立枯絲核菌AG-1IAG蛋白β亞基基因在不同時期的表達量分析顯示，水稻立枯絲核菌G蛋白β亞基基因在前2d幾乎不表達，從第3天到第5天基因的表達量逐漸增大，在第5天時達到最大，第6天后表達量陡然降低到幾乎不表達。因此，水