水稻抗白葉枯病基因Xa23的圖位克隆.pdf

1、本研究利用JG30與CBB23雜交F2代的2562個單株為作圖群體，對Xa23基因進行精細定位；BAC文庫構(gòu)建；Shotgun文庫測序；遺傳轉(zhuǎn)化等方法克隆Xa23基因。主要結(jié)果如下： 1.EST分子標記定位：根據(jù)日本水稻基因組計劃RGP的數(shù)據(jù)，篩選并合成12個EST標記的引物，進行親本間多態(tài)性檢測。找到2個在CBB23與JG30間有多態(tài)性的標記C189和CP02662。用C189標記對F2群體中的571個感病單株進行分子檢測和連

2、鎖分析，結(jié)果表明該標記與Xa23的遺傳距離為0.8cM。將C189成功用于水稻分子育種實踐，標記輔助選擇的正確率接近100％。 2.利用相關(guān)基因組文庫進行分子標記定位：通過篩選水稻明恢63的TAC文庫和廣陸矮4號的PAC文庫，獲得15個末端片段，其中6個末端片段在雙親間有多態(tài)性，分別為69B、81N、45B、45N、84N和84B。這些標記與Xa23的遺傳距離依次為0.4、0.4、0.5、0.6、0.6和1.1cM。加密了Xa2

3、3基因一側(cè)的遺傳圖譜，并使其遺傳距離縮短到0.4cM。 3.開發(fā)新的PCR標記進行Xa23基因精細定位：依據(jù)國際水稻基因組計劃測序的水稻品種日本晴的序列及上述定位的區(qū)域為依據(jù)設(shè)計特異引物，共開發(fā)出8個新的分子標記Lj13、Lj36、Lj46、Lj55、Lj204(Lj74)、Lj210、Lj211和Lj215。用這些標記對F2群體感病單株進行分子檢測和連鎖分析，標記Lj36、Lj46和Lj211與Xa23的遺傳距離分別為0.4c

4、M、0.3cM和0.2cM，位于同一側(cè)，Lj13與Xa23的遺傳距離為1.1cM，位于基因另一側(cè)，Lj204(Lj74)、Lj210、Lj215和Lj55與Xa23的遺傳距離為0cM，與Xa23基因共分離。 4.構(gòu)建了CBB23CopyControlpCC1BAC文庫，該文庫包含36，096個克隆，平均插入片段108Kb，覆蓋水稻基因組9.1倍。用緊密連鎖標記Lj211和共分離標記Lj74篩選BAC文庫，得到5個陽性克隆64F1

5、6、71H3、91A1、6O8和59F8，建立了跨疊克隆群，將Xa23基因鎖定在BAC克隆6O8內(nèi)，經(jīng)脈沖電泳檢測其插入片段為80Kb左右。 5.對BAC克隆6O8進行鳥槍法(Shotgun)全序列測定，成功獲得72115bp的DNA連續(xù)序列。通過基因預測共有12個開放閱讀框(ORFs)，分別編碼不同的基因，根據(jù)ORF編碼產(chǎn)物的同源性比較以及分子標記的位置，最后鎖定6個ORFs為侯選基因。 6.運用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將選取

6、的10個侯選基因克隆載體轉(zhuǎn)化到受體品種中，共得到1350株轉(zhuǎn)基因苗。其中侯選基因載體T189轉(zhuǎn)化受體牡丹江的258株T0代轉(zhuǎn)基因苗，經(jīng)田間接種鑒定，有23株表現(xiàn)抗病，其中17株表現(xiàn)高抗，6株表現(xiàn)中抗。其它侯選基因克隆的轉(zhuǎn)基因苗對小種P6都表現(xiàn)感病。潮霉素基因Southern雜交檢測抗病株拷貝數(shù)，高抗和中抗中既有單拷貝又有雙拷貝，證明所有抗病株都是轉(zhuǎn)基因。結(jié)果表明T189含有的基因就是本研究所克隆的目標基因Xa23，成功克隆Xa23基因。