水稻抗白葉枯病相關(guān)基因OsCRK1的鑒定和克隆.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、由黃單胞桿菌引起的水稻白葉枯病是世界性水稻病害,嚴(yán)重制約水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。多年的實(shí)踐證明,種植抗病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。雖然已經(jīng)鑒定出39個(gè)水稻抗白葉枯病基因,但被育種利用的并不多。因此挖掘和克隆新的抗白葉枯病基因是水稻抗病育種的客觀要求。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)在新基因的發(fā)掘、代謝途徑確定、基因家族鑒定及進(jìn)化分析等多方面顯示出極大的效力。我們從野生稻中挖掘出一個(gè)高抗白葉枯病資源,并培育出以IR24(感病)為背景的近等基

2、因系5024(抗?。?。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對這對近等基因系進(jìn)行測序,通過測序結(jié)果分析、qRT-PCR驗(yàn)證、RNAi干擾分析等手段獲得抗病相關(guān)基因。
  獲得的主要研究結(jié)果如下:
  1.用國內(nèi)外25個(gè)白葉枯病代表菌系對近等基因系5024接種鑒定,結(jié)果5024對23個(gè)菌系表現(xiàn)高抗。與已知白葉枯病抗性基因比較抗譜,發(fā)現(xiàn)5024與其他基因的抗譜均不相同,抗譜上優(yōu)于Xa21,僅次于Xa23,表明5024可能含有新的抗白葉枯病基因

3、。
  2.對用強(qiáng)致病菌PXO99(P6)注射接種處理的近等基因系IR24和5024進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,分別獲得91022599和105644962條序列。通過測序結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)203個(gè)基因的表達(dá)有顯著差異,其中5024比IR24表達(dá)量上調(diào)的有114(56.2%)個(gè),下調(diào)的有89(43.8%)個(gè)。并且差異表達(dá)顯著基因在第11染色體上的分布明顯多于其它染色體。
  3.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在203個(gè)差異表達(dá)基因中有16個(gè)類抗病基因,

4、14個(gè)過氧化物代謝相關(guān)基因,6個(gè)抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,16個(gè)信號傳導(dǎo)相關(guān)基因。
  4.對在5024中表達(dá)上調(diào)而在IR24中下調(diào)的6個(gè)基因(包括3個(gè)預(yù)測抗病相關(guān)基因,3個(gè)未知蛋白)進(jìn)行RT-PCR與qRT-PCR分析,表達(dá)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。其中的一個(gè)基因(編號ZW22,后命名為OsCRK1)在5024中表達(dá)量隨接種時(shí)間0d、1d和2d逐漸增高,而在IR24中檢測不到表達(dá)。表明OsCRK1與抗病相關(guān),且受P6誘導(dǎo)表達(dá)。
 

5、 5.用長鏈PCR擴(kuò)增出5024中OsCRK1基因的全長,經(jīng)測序分析OsCRK1基因編碼區(qū)長度為1371bp,編碼457個(gè)氨基酸,基因包含6個(gè)外顯子。
  6.選擇OsCRK1基因3個(gè)外顯子片段,構(gòu)建RNAi表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化5024后獲得38株轉(zhuǎn)基因苗,用P6菌剪葉接種,14天后量取病斑長度,發(fā)現(xiàn)有10株表現(xiàn)感病,病斑長度平均在8.6cm,與感病對照IR24的病斑長度(9.3cm)相比無明顯差異,與抗病供體對照5024

6、的病斑長度(2.0cm)相比差異顯著。
  7.將RNAi表達(dá)載體部分序列與OsCRK1基因內(nèi)部引物配對,對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR分子檢測,結(jié)果表明這些表現(xiàn)感病的植株都是由于RNAi干擾所致。
  8.qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了上述RNAi轉(zhuǎn)基因植株中OsCRK1表達(dá)量都顯著下降,其表達(dá)水平與IR24的相近。上述結(jié)果表明OsCRK1基因沉默后影響了水稻對白葉枯病的抗性,進(jìn)一步證明該基因與白葉枯病抗性密切相關(guān)。
  

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