血管功能藥理學(xué)以及重大心臟疾病的致病基因和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、本論文對常見的三種心臟疾?。ü谛牟?、心臟瓣膜病以及先天性心臟病）的不同方面分別進行了研究。論文第一部分對治療冠心病的冠狀動脈旁路移植外科手術(shù)中移植血管的功能進行了藥理學(xué)研究。第二部分對心臟瓣膜病進行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，同時對可能與先天性心臟病相關(guān)的PLAGL1基因進行了突變分析的研究。
　　第一部分血管功能藥理學(xué)與冠狀動脈旁路移植術(shù)
　　研究背景及目的:
　　移植血管痙攣仍然是冠狀動脈旁路移植術(shù)中的挑戰(zhàn)。臨床上鈣拮抗

2、劑常用于治療冠心病患者。本部分我們將對新型第三代二氫吡啶類鈣拮抗劑阿折地平在人體內(nèi)乳動脈中對于血管收縮的抑制效應(yīng)進行研究。
　　內(nèi)皮細胞胞內(nèi)的鈣調(diào)節(jié)依賴于瞬時受體電位通道(TRPs)。標(biāo)準(zhǔn)型瞬時受體電位離子通道(TRPCs)目前被認為是血管內(nèi)皮細胞中最重要的鈣離子透過性陽離子通道而TRPC3通道被報道在動物動脈中與血管的舒張功能相關(guān)。然而，TRPCs在人體動脈中的作用尚不明確。因此我們對科研假說，標(biāo)準(zhǔn)型瞬時受體電位離子通道在人體動

3、脈中發(fā)揮作用，進行了驗證。
　　實驗方法:
　　離體的內(nèi)乳動脈環(huán)（n=68，來自28個進行冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者）在myograph上進行兩方面研究:阿折地平對KCl和U46619預(yù)收縮的內(nèi)乳動脈的舒張作用以及在正常血藥濃度時阿折地平對收縮的抑制作用。
　　人體內(nèi)乳動脈環(huán)（n=42，來自28個進行冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者）按如下方法在myograph上進行研究:分別作出以U46619(-8 log M)預(yù)收縮后乙酰膽

4、堿的濃度依賴性舒張曲線，記錄在加入SKF96365(10μmol/L)或者Pyr3(3μmol/L)孵育前后曲線的變化。同時利用Western Blot和免疫組化對TRPC3蛋白的表達進行鑒定。
　　實驗結(jié)果:
　　阿折地平能夠幾乎完全舒張KCl(96.5％±0.7％)或U46619(96.5％±1.4％)預(yù)收縮的人體內(nèi)乳動脈(n=8)且對KCl的敏感性相對U46619更高(EC50∶-7.49±0.21 vs-6.03±0

5、.11 logM，p＜0.01）;預(yù)孵育阿折地平(-6.1 log M)可以有效的抑制KCl(最大收縮值從25.8±2.2 mN下降至16.0±1.5 mN，p＜0.01)或U46619(最大收縮值從30.6±4.0 mN下降至16.5±2.2 mN，p＜0.05)引起的人體內(nèi)乳動脈收縮。
　　由乙酰膽堿引起的最大舒張值由于非特異性陽離子通道抑制劑SKF96365(48.2±3.7 vs.66.0±0.9％ in control，

6、P＜0.01)或TRPC3通道特異性抑制劑Pyr3(58.4±2.3％ vs.67.7±1.1％ in control，P＜0.01)而明顯減小。同時，在人體內(nèi)乳動脈中檢測到TRPC3通道蛋白的表達。
　　實驗結(jié)論:
　　阿折地平對于不同類型的血管收縮劑在人體內(nèi)乳動脈中引起的收縮均具有有效的抑制作用。因此，阿折地平應(yīng)用于冠狀動脈旁路移植術(shù)患者有望可以有效治療和預(yù)防移植血管的痙攣。
　　TRPC3通道存在于人體內(nèi)乳動脈中

7、，并且在乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用中發(fā)揮功能。本部分研究提示TRPC3可能成為在內(nèi)皮功能障礙疾病如冠心病中潛在的保護內(nèi)皮功能以改善移植血管遠期通暢率的靶點。
　　第二部分重大心臟疾病的致病基因和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究
　　研究背景及目的:
　　心臟瓣膜病的遺傳基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究能夠為診斷和治療此類疾病提供重要信息。然而，關(guān)于心臟瓣膜病(VHD)包括風(fēng)濕性(RVD)和退行性心臟瓣膜病(DVD)生物標(biāo)記物的研究尚不明確。

8、本部分實驗意在探索血漿中表達量變化與心臟瓣膜病的病理變化相關(guān)的蛋白質(zhì)。
　　室間隔缺損(VSD)是最常見的先天性心臟病之一。許多遺傳學(xué)研究提示PLAGL1基因與先天性心臟病的病因?qū)W相關(guān)。本部分的研究意在鑒別PLAGL1基因中潛在的致病突變，為單純性室間隔缺損的病因?qū)W研究提供參考。
　　實驗方法:
　　采用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜的方法對RVD、DVD和正常人群對照組的血漿進行差異蛋白質(zhì)的檢測。同時對找出的差異蛋白中可能與VHD

9、病理變化相關(guān)的蛋白質(zhì)進行ELISA驗證。
　　300例單純性VSD患者和300例健康人群PLAGL1基因中兩個編碼蛋白的外顯子經(jīng)PCR擴增后，PCR產(chǎn)物采用ABI公司3730自動測序儀測序。應(yīng)用CLCworkbench software對PLAGL1蛋白進行多物種氨基酸保守性分析。
　　實驗結(jié)果:
　　雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜共找出差異蛋白點18個，包括14個蛋白質(zhì)或者多肽。對兩個上調(diào)的（補體C4A和碳酸酐酶1）和三個下調(diào)的（

10、血清鐵傳遞蛋白、alpha-1抗胰凝乳蛋白酶和波連蛋白）可能與VHD病理變化相關(guān)的蛋白質(zhì)進行ELISA驗證。補體C4A在RVD病人血漿中含量(715.8±35.6 vs.594.7±28.2 ng/ml，n=40，P=0.009)以及碳酸酐酶1在DVD病人血漿中含量(237.70±15.7 vs.184.7±10.8 U/L，n=40，P=0.007)均較正常對照組顯著升高。血清鐵傳遞蛋白在RVD病人血漿中含量(2.36±0.20 vs

11、.2.93±0.16 mg/ml，n=40，P=0.025)以及alpha-1抗胰凝乳蛋白酶在RVD病人血漿中含量(370.0±13.7 vs.413.0±11.6μg/ml，n=40，P=0.019)較正常對照組顯著降低。此外，波連蛋白在RVD病人(281.3±11.0 vs.323.2±10.0μg/ml, n=40, P=0.006)和DVD病人(283.6±11.4 vs.323.2±10.0μg/ml，n=40，P=0.011

12、)血漿中含量均較正常對照組顯著降低。
　　在PLAGL1基因兩個編碼蛋白的外顯子中未檢測到任何錯義突變或移碼突變，只在編碼蛋白的外顯子2中檢測到一個同義突變(c.486A＞G，p.E162E)。突變位置的密碼子翻譯的谷氨酸在與其他物種的比對中顯示具有保守性。
　　實驗結(jié)論:
　　補體C4A在RVD病人血漿中含量的上升，碳酸酐酶1在DVD病人血漿中含量的上升，血清鐵傳遞蛋白在RVD病人血漿中含量的下降以及alpha-1抗