99mTc-EGFR Nanobodies用于腫瘤放射免疫顯像的初步研究.pdf

1、目的
　　本研究應(yīng)用放射性核素99mTc標(biāo)記基因工程小分子抗體—EGFRNanobody制備新型分子探針,以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為生物靶點(diǎn),通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)觀察不同組織來(lái)源癌細(xì)胞及移植瘤組織對(duì)99mTc-EGFRNanobody單體及3種多聚體(四、五和七聚體)的結(jié)合及SPECT顯像特性,篩選理想的99mTc-EGFRNanobody用于腫瘤放射免疫顯像,同時(shí)分析其可能的機(jī)制,為這一類(lèi)新型顯像劑的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2、r>　　方法
　　體外培養(yǎng)人不同組織來(lái)源癌細(xì)胞,包括人表皮癌A431細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞、卵巢癌SKOV3細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞、人前列腺癌DU-145及人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤OCM-1細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)上述細(xì)胞EGFR的表達(dá);Westernblot半定量分析不同癌細(xì)胞EGFR蛋白含量及差異。
　　首先合成三羰基锝,然后與EGFRNa

3、nobodies六聚組氨酸標(biāo)簽鏈接完成標(biāo)記,標(biāo)記混合物采用超濾離心法純化,薄層層析法(TLC)測(cè)定放化純,以硅膠板為固定載體,分別以0.9％氯化鈉溶液和丙酮為流動(dòng)相垂直上行展開(kāi)。12孔板培養(yǎng)4種不同EGFR表達(dá)癌細(xì)胞(A431,A549,NCI-H460,OCM-1),每孔加入100μL含0.5%HEPES和0.5%BSA的混合液用于封閉非特性結(jié)合。分組設(shè)99mTc-EGFRNanobody單體、99mTc-EGFRNanobody四聚

4、體、99mTc-EGFRNanobody五聚體和99mTc-EGFRNanobody七聚體組;組內(nèi)設(shè)競(jìng)爭(zhēng)阻斷組,即每孔細(xì)胞預(yù)先加入2μg相應(yīng)未標(biāo)記的EGFRNanobody(10μL),37℃孵育1h后再加入相應(yīng)標(biāo)記抗體;每孔細(xì)胞內(nèi)均加入1μCi(37KBq)99mTc-EGFRNanobody(1μg,10μL),37℃孵育1h;以99mTcO4-為陰性對(duì)照組,以上各組均設(shè)4個(gè)平行管。分離并收集每孔細(xì)胞及上清液,γ計(jì)數(shù)器測(cè)定其放射性計(jì)

5、數(shù)(CPM),計(jì)算癌細(xì)胞對(duì)標(biāo)記抗體的結(jié)合率。
　　BLAB/C-nu小鼠左上肢近腋窩皮下種植A431、A549、SKOV3和OCM-1癌細(xì)胞(0.5-1×107細(xì)胞/150μL)制備移植瘤小鼠模型,待腫瘤直徑長(zhǎng)至約1.0cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。移植瘤小鼠尾靜脈注射100μL99mTc-EGFRNanobodies(7.4-18.5MBq),于30、60、90、120及180min分別行SPECT全身顯像,配針孔準(zhǔn)直器采集圖像,觀察移植瘤小

6、鼠的放射性分布,通過(guò)勾畫(huà)感興趣區(qū)(ROI)計(jì)算移植瘤T/NT比值,分析4種標(biāo)記抗體在不同癌細(xì)胞移植瘤小鼠體內(nèi)的分布及腫瘤組織顯像特點(diǎn)。顯像結(jié)束后處死動(dòng)物,切取腫瘤組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)移植瘤組織EGFR表達(dá)水平。
　　統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,SPSS統(tǒng)計(jì)分析,組間比較用單因素方差分析,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　7種癌細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,增殖迅速,形態(tài)各異,EGFR表達(dá)水平存在

7、差異,其中A431,A549,NCI-H460,SKOV3細(xì)胞為EGFR陽(yáng)性表達(dá),MDA-MB-453和DU145細(xì)胞為弱陽(yáng)性表達(dá),OCM-1細(xì)胞為陰性表達(dá)。
　　99mTc標(biāo)記EGFRNanobodies超濾離心后放化純均大于95%,體外6h內(nèi)穩(wěn)定。A431,A549,NCI-H460細(xì)胞對(duì)4種99mTc-EGFRNanobody均有不同程度的結(jié)合率,明顯高于對(duì)照組99mTcO4-;各組細(xì)胞未標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)阻斷后,結(jié)合率均出現(xiàn)下降

8、,部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR陰性表達(dá)OCM-1細(xì)胞對(duì)4種99mTc-EGFRNanobody也有不同程度的結(jié)合率。
　　EGFR表達(dá)陽(yáng)性的A431移植瘤小鼠靜脈注射99mTc-EGFRNanobody五聚體90min后,腫瘤組織顯示較清晰,最高T/NT=2.9。99mTc-EGFRNanobody單體、四聚體和七聚體在4種移植瘤組織均未見(jiàn)明顯濃聚,其中99mTc-EGFRNanobody單體主要濃聚于腎臟和膀胱

9、,99mTc-EGFRNanobody四聚體和七聚體肝臟明顯濃聚,腎臟和膀胱有部分濃聚。
　　結(jié)論
　　不同的癌細(xì)胞具有EGFR表達(dá)差異。三羰基锝標(biāo)記EGFRNanobodies方法簡(jiǎn)便可行。4種不同99mTc-EGFRNanobody在不同癌細(xì)胞的體外結(jié)合與體內(nèi)移植瘤SPECT顯像存在不一致。EGFR表達(dá)陽(yáng)性的癌細(xì)胞與4種99mTc-EGFRNanobodies均有一定的結(jié)合率,可被未標(biāo)記相應(yīng)抗體部分阻斷。體內(nèi)移植瘤模型S