miR-34a-SIRT1信號通路參與慢性牙髓炎疼痛的中樞調控機制研究.pdf

1、慢性牙髓炎是指發(fā)生于牙髓組織的慢性炎癥性病變，主要表現(xiàn)為劇烈的疼痛，嚴重影響患者的身心健康和生活質量。兒童除具有以上影響外，還可能因疼痛而導致偏側咀嚼，進而影響頜骨發(fā)育及顏面部形態(tài)。當牙髓發(fā)生炎癥或損傷時，延髓背角在細胞形態(tài)、基因表達及突觸連接等方面發(fā)生變化，從而參與炎癥疼痛下延髓水平的中樞敏化過程，形成牙髓炎特征性的刺激痛等癥狀?，F(xiàn)在越來越多的實驗表明：miRNA是一種新層次上的基因表達調控方式，參與背根神經節(jié)、脊髓背角等處疼痛狀態(tài)下

2、疼痛相關基因表達的改變。但迄今為止的，miRNA是否參與牙髓炎疼痛的中樞調控尚屬新的領域，國內外未見報道。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：開髓暴露法可產生理想的慢性牙髓炎痛敏模型；基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，慢性牙髓炎術后1天大鼠延髓背角多種miRNA分子變化顯著，其中miR-34a表達顯著降低；而文獻報道m(xù)iR-34a可調控多種疼痛相關基因的表達與活性。這為我們研究慢性牙髓炎疼痛的中樞調控機制提供了新思路：miR-34a可否作為一

3、種基因表達調控方式，參與慢性牙髓炎疼痛狀態(tài)下，延髓背角內疼痛相關基因表達的改變?；谝陨霞僭O，我們設計如下實驗，旨在探索慢性牙髓炎疼痛的中樞調控機制，從而為研發(fā)牙髓炎鎮(zhèn)痛藥物提供新的靶點和思路。
　　目的：
　　本課題擬從miRNA分子參與慢性牙髓炎疼痛中樞調控入手，篩選出miR-34a及其下游靶基因SIRT1；通過檢測牙髓炎模型術后不同時間點延髓背角miR-34a、SIRT1的表達變化及細胞定位分析，探討miR-34a、S

4、IRT1與慢性牙髓炎疼痛之間的關系；通過慢病毒感染過表達miR-34a、鞘內給予白藜蘆醇過表達SIRT1分子，探討miR-34a分子是否通過抑制下游靶基因SIRT1的表達水平，進而參與慢性牙髓炎疼痛的中樞調控機制。
　　方法：
　　1．建立慢性牙髓炎痛敏模型：健康成年雄性SD大鼠，隨機分為牙髓炎組和對照組；牙髓炎組麻醉后于左側上頜第一磨牙，用1/2球鉆開髓并使之暴露于口腔，對照組麻醉后不作處理。于術前1d、術后1、3、7、1

5、4d檢測擦面行為總時間，評估大鼠疼痛反應；不同時間點取延髓和牙髓，制作延髓冰凍切片及牙髓石蠟切片，用免疫熒光染色方法檢測延髓中c-Fos蛋白及牙髓中TNF-α的表達情況，HE染色觀察牙髓的炎癥情況。
　　2．基因芯片篩選出牙髓炎術后1d組與對照組之間的差異miR-34a分子；實時定量PCR進一步驗證；原位雜交和免疫熒光雙標技術定位miR-34a表達的細胞類型；通過軟件分析及文獻回顧，預測miR-34a可能作用的靶基因；實時定量PC

6、R和免疫熒光技術對靶基因進一步驗證；免疫熒光雙標技術定位SIRT1表達的細胞類型。
　　3．外科手術暴露大鼠延髓背角，體內感染miR-34a慢病毒過表達載體，感染3w后建立慢性牙髓炎痛敏模型，術后1d檢測大鼠疼痛行為及同側延髓背角miR-34a、SIRT1的表達水平；小腦延髓池白藜蘆醇鞘內置管連續(xù)給藥過表達SIRT1，牙髓炎術后1d檢測實驗大鼠痛行為變化。
　　結果：
　　1．痛行為學結果顯示：牙髓炎疼痛具有時間相關性

7、，術后1d疼痛達到峰值，隨后疼痛程度逐漸降低；HE染色結果表明：牙髓炎術后1、3、7、14d，牙髓炎癥和壞死組織邊緣分別位于髓角、根頸1/3、根中1/3和根尖1/3處；牙髓TNF-α免疫熒光染色主要表達于鄰近壞死層的炎性牙髓組織內，急性期（術后1d）表達最高；c-Fos免疫熒光染色結果顯示，術后2h延髓背角c-Fos陽性細胞顯著增多，提示延髓背角細胞活化。
　　2．基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠延髓背角多種miRNA分子變化顯著，其中mi

8、R-34a表達降低；qPCR結果表明，與對照組相比，牙髓炎術后miR-34a表達顯著下調，除術后14d外，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。熒光原位雜交及免疫熒光雙標結果顯示：延髓背角有大量miR-34a雜交信號并與神經元標記物 NeuN共存，提示miR-34a主要表達于神經元；與對照組相比，實驗組大鼠同側延髓背角miR-34a顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過軟件預測及文獻回顧分析，我們選取Bcl-2、SIRT1、P5

9、3、HGF、Notch-1、USF-1和Met為可疑靶基因，通過qPCR進一步篩選出SIRT1為miR-34a在慢性牙髓炎疼痛調控中的下游靶基因。qPCR及免疫熒光進一步驗證顯示：牙髓炎術后SIRT1表達顯著上調，牙髓炎術后3d，SIRT1表達最高，隨后表達逐漸降低，與對照組相比差異明顯，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫熒光雙標結果顯示：延髓背角內 SIRT1與神經元標記物NSE共存，與細胞核標記物DAPI少量共存，提示SIRT1分子

10、主要表達在神經元胞質內。
　　3．體內慢病毒感染過表達miR-34a后：慢性牙髓炎術后1d，大鼠疼痛程度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比，miR-34a顯著增加3.25倍，SIRT1降低0.45倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小腦延髓池連續(xù)給予SIRT1激動劑白藜蘆醇后：SIRT1顯著增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；慢性牙髓炎術后1d疼痛程度降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(

11、P<0.05)。
　　結論：
　　1．牙髓暴露法操作簡單，能有效的模擬臨床牙髓炎及其痛敏過程，可構建理想的實驗性牙髓炎痛敏模型；
　　2．在延髓背角，miR-34a和SIRT1主要表達于神經元；慢性牙髓炎狀態(tài)下，miR-34a顯著降低、SIRT1顯著增加，且具有時間相關性，提示miR-34a、SIRT1分子與慢性牙髓炎疼痛關系密切；
　　3．SIRT1具有神經保護作用，過表達SIRT1能發(fā)揮明顯的牙髓炎鎮(zhèn)痛作用；