LPS-D-gal誘導(dǎo)急性肝炎小鼠模型的建立及mTOR信號(hào)通路的初步探索.pdf

1、急性肝炎作為臨床上一種常見病癥，其危害極其嚴(yán)重。然而到目前為止，其致病機(jī)制還不是很清楚。動(dòng)物模型是研究該病的重要工具。脂多糖/D-氨基半乳糖胺（Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-gal）誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)小鼠急性肝炎模型是目前應(yīng)用比較廣泛的動(dòng)物模型，其能夠較好地模擬病毒性肝炎等急性肝炎的致病過程。對(duì)于該模型的一些研究表明LPS與D-gal在體內(nèi)是通過不同的機(jī)制參與急性肝炎的致病過程，然而其具體機(jī)制

2、還有待進(jìn)一步的研究。因此，深入研究LPS與D-gal各自在其中發(fā)揮的作用具有重要意義。另外，研究表明LPS/D-gal致病過程主要涉及到炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，據(jù)報(bào)道m(xù)TOR信號(hào)通路在這兩個(gè)病理過程中發(fā)揮重要作用。因此，探索mTOR信號(hào)在此疾病模型中變化對(duì)于認(rèn)識(shí)急性肝炎的致病機(jī)制和抗肝炎藥物的研發(fā)具有一定的理論價(jià)值。
　　本論文主要分為三部分。首先是建立急性肝炎模型。以ICR、FVB、C57BL6三種不同品系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究LP

3、S/D-gal誘導(dǎo)急性肝炎的最佳藥物劑量以及性別差異對(duì)模型建立的影響。并以ICR小鼠為代表進(jìn)行LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎模型建立的相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)，以及對(duì)LPS/D-gal作用不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。其次，以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)LPS與D-gal在該疾病模型中的作用機(jī)制進(jìn)行了探索:(1)分別用LPS或D-gal單獨(dú)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠，研究它們各自在急性肝炎致病過程中的作用;(2)利用LPS預(yù)處理D-gal致敏的實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察小鼠存活情況

4、，分析LPS預(yù)處理改變存活率的原因;(3)實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)D-gal致敏后，再用LPS進(jìn)行誘導(dǎo)，分析D-gal在體內(nèi)代謝的時(shí)間，以及一定程度的肝損傷對(duì)LPS作用的影響。最后，我們通過免疫印跡分析了mTOR信號(hào)途徑在LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎中的變化，并通過抑制mTOR途徑來研究其在LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎中可能發(fā)揮的作用。
　　通過上述實(shí)驗(yàn)我們得到以下結(jié)果:
　　(1)一定劑量LPS/D-gal聯(lián)合作用均可引起ICR

5、、FVB、C57BL6三種不同品系小鼠產(chǎn)生致死性的急性肝炎，死亡時(shí)間均發(fā)生在6h以后。經(jīng)過比較性別差異發(fā)現(xiàn)雌性小鼠對(duì)LPS/D-gal聯(lián)合作用反應(yīng)更敏感。急性肝炎相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):ICR雌性小鼠經(jīng)LPS/D-gal處理后6h，血清中轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高這說明肝臟組織受到了嚴(yán)重的損傷，病理切片結(jié)果確認(rèn)了肝組織損傷。我們還發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子TNFα、IL1β、IL6的mRNA表達(dá)水平顯著升高，凋亡相關(guān)蛋白Caspase3被激活和裂解，NF-

6、κB信號(hào)途徑和mTOR信號(hào)途徑均被激活。這些結(jié)果表明我們通過LPS/D-gal成功地誘導(dǎo)了ICR小鼠的急性肝炎及肝損傷。
　　(2) LPS或D-gal單獨(dú)作用均不能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠死亡。LPS作用主要誘導(dǎo)了炎性因子TNFα及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)。前者主要引起炎癥反應(yīng)發(fā)生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，后者則發(fā)揮抗凋亡和肝細(xì)胞保護(hù)作用。而抗炎因子IL10的mRNA表達(dá)水平顯著升高以及NF-κB信號(hào)途徑被抑制表明LPS可能通過激活抗炎反應(yīng)阻止炎

7、癥反應(yīng)的過度發(fā)生。另外，免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的LPS可以誘導(dǎo)激活mTOR信號(hào)途徑。D-gal作為RNA合成的類似物抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)肝臟組織細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，在D-gal作用6h后IκBα水平下降，表明NF-κB途徑被激活，但炎性因子TNFα的mRNA表達(dá)水平則沒有明顯變化，表明NF-κB途徑可能在其中發(fā)揮其它作用。接下來，我們探討了LPS在D-gal致敏小鼠前后的作用。我們發(fā)現(xiàn)在LP

8、S預(yù)處理1h內(nèi)，炎性因子TNFα和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)水平均逐步升高，抗炎因子IL10的表達(dá)水平則沒有明顯變化。存活率分析發(fā)現(xiàn)，LPS提前1h預(yù)處理D-gal致敏小鼠，對(duì)小鼠有一定的保護(hù)作用。而小鼠經(jīng)D-gal致敏后，LPS則能加速小鼠死亡。
　　(3)免疫印跡分析表明，mTOR信號(hào)的激活與LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎有一定的相關(guān)性。意想不到的是，mTOR的抑制劑Rapamycin盡管能夠抑制mTOR信號(hào)，但并不能有效

9、降低LPS/D-gal誘導(dǎo)急性肝炎的小鼠死亡，這提示mTOR信號(hào)在LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎中可能起多重作用。
　　綜上所述，本研究通過LPS/D-gal成功地在3種不同品系的小鼠中誘導(dǎo)了急性肝炎，找到了適合于每一種小鼠的最佳LPS/D-gal使用劑量，并且還發(fā)現(xiàn)性別影響實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)LPS/D-gal的敏感性，雌性小鼠是建立該模型理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在LPS/D-gal誘導(dǎo)ICR雌性小鼠急性肝炎中，LPS的主要作用是促使炎性因子的

10、大量表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，在后期LPS也激發(fā)了抗炎反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNFα可能通過激活細(xì)胞內(nèi)死亡受體誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，然而LPS同時(shí)激活了NF-κB信號(hào)通路啟動(dòng)抗凋亡的保護(hù)機(jī)制，因此單獨(dú)使用LPS不能引起明顯的細(xì)胞凋亡。D-gal通過抑制抗凋亡蛋白的合成，從而增加肝細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)分泌的TNFα的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最后，在LPS/D-gal誘導(dǎo)的急性肝炎模型中mTOR信號(hào)途徑被激活，然而其在此過程中發(fā)揮的作用還有待進(jìn)一步