康萊特聯(lián)合非替尼對(duì)肺癌A549細(xì)胞P-Akt、C-Met表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是當(dāng)代世界常見(jiàn)惡性腫瘤之一，已居多數(shù)國(guó)家癌癥死亡原因的首位。近些年來(lái)新的分子靶向藥物表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的出現(xiàn)為NSCLC的治療帶來(lái)了曙光。吉非替尼是一種口服的有活性、選擇性的EGFR-TKIs，目前已成為肺癌分子靶向治療中較為成熟的藥物。臨床研究已表明，吉非替尼單藥治療各種類(lèi)型NSCLC的總有效率僅為10％～20％，因此人們希望與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用以進(jìn)一步提高抗腫瘤效應(yīng)

2、?？等R特注射液是一種中藥制劑，由中藥薏苡仁中提取出的薏苡仁油制成，研究表明其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均能有較強(qiáng)的殺傷及抑制作用。一些小樣本臨床研究發(fā)現(xiàn)，康萊特聯(lián)合化療能顯著提高晚期NSCLC的治療效果。目前已有許多研究證明PI3K/Akt信號(hào)通路在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。約有50％-70％的NSCLC中存在Akt的磷酸化即p-Akt，這表明PI3K/Akt信號(hào)通路的激活在NSCLC中很常見(jiàn)。c-Met蛋白是一種由原癌基因c-Met編碼

3、、具有酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體，可與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)特異性結(jié)合，激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、活力、遷移、血管形成、侵襲以及形態(tài)發(fā)生等。c-Met信號(hào)的改變能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究結(jié)果顯示在NSCLC中非靶受體c-Met繼發(fā)性過(guò)表達(dá)與吉非替尼的繼發(fā)性耐藥有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用一系列實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)檢測(cè)藥物處理后的人肺腺癌A549細(xì)胞株中細(xì)胞凋亡率、p-Akt及c

4、-Met的mRNA及蛋白等的表達(dá)來(lái)探索吉非替尼聯(lián)合康萊特對(duì)A549細(xì)胞株的作用及其機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，吉非替尼組，康萊特組，吉非替尼聯(lián)合康萊特組;吉非替尼組設(shè)置濃度梯度為:0.1、0.5、1、5、10、20、40μmol/L，作用時(shí)間:24h、48h、72h;康萊特設(shè)置濃度梯度為:5、10、20、40、80、100、160μl/ml，

5、作用時(shí)間:24h、48h、72h;聯(lián)合用藥組:根據(jù)康萊特抑制率求IC50，吉非替尼選擇本實(shí)驗(yàn)中最高作用濃度;應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay，MTT)法分別測(cè)定各藥物不同濃度、不同作用時(shí)間的抑制率。
　　 2、根據(jù)MTT結(jié)果，康萊特IC50=80μl/ml，故聯(lián)合用藥組康萊特取80μl/ml，吉非替尼選擇本實(shí)驗(yàn)中最高作用濃度40μmol/L，共同處理48h后，應(yīng)用流式細(xì)胞

6、學(xué)檢測(cè)各處理組中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況。
　　 3、選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置入六孔板培養(yǎng)，組別設(shè)置同上。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）染色法檢測(cè)各組藥物處理后細(xì)胞內(nèi)p-Akt、c-Met蛋白含量的變化。
　　 4、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，組別設(shè)置同上。藥物作用48h后提取RNA，檢測(cè)總RNA的量、純度及完整性，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈

7、反應(yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)半定量檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞內(nèi)c-Met mRNA的表達(dá)水平。
　　 5、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS18.0統(tǒng)計(jì)處理，采用正態(tài)性檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異非常顯著。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT結(jié)果顯示:
　　 1.1、與對(duì)照組相比，隨著康萊特濃度及作用時(shí)間的增加，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率逐漸升高，其抑制作用有劑量效應(yīng)

8、及時(shí)間效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系;
　　 1.2、聯(lián)合用藥組:康萊特聯(lián)合吉非替尼培養(yǎng)48h后，兩藥聯(lián)合作用抑制率高于各單藥組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 1.3、與對(duì)照組相比，吉非替尼組對(duì)A549細(xì)胞有一定程度的抑制作用，但作用并不明顯。
　　 2、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示:
　　 2.1、作用于細(xì)胞48h后，各單藥組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率均顯著增加;
　　 2.2、聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率高于單藥康萊特組、單藥

9、吉非替尼組，有顯著性差異（P＜0.05）;
　　 3、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:
　　 與對(duì)照組相比，康萊特組作用于A549細(xì)胞48h后，均能下調(diào)p-Akt、c-Met蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，P＜0.05;吉非替尼組作用不明顯，P＞0.05;聯(lián)合用藥組較吉非替尼組顯著下調(diào)p-Akt、c-Met蛋白表達(dá)，P＜0.05。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示:
　　 4.1、康萊特組c-Met mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)

10、，吉非替尼組則無(wú)明顯作用;
　　 4.2、兩藥聯(lián)合組c-Met mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組及吉非替尼組均下調(diào)明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1、康萊特對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的抑制率在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度、作用時(shí)間的增加而增加，并呈劑量-時(shí)間依賴(lài)性;康萊特聯(lián)合吉非替尼作用于A549細(xì)胞株48h的抑制率高于各單藥處理組;根據(jù)金氏公式計(jì)算q值，表明兩藥聯(lián)合可能具有一定的協(xié)同增效作用。
　　 2、康萊特組、吉非替尼