依他尼酸聯(lián)合順鉑化療促肺癌A549細胞球凋亡的作用及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　探討依他尼酸（EA)聯(lián)合順鉑對A549細胞球的殺傷效應(yīng)及機制。
　　方法：
　　1、以無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM)的方法誘導(dǎo)A549細胞形成A549細胞球。
　　2、應(yīng)用 Western blot檢測 CD133、SOX2、EpCAM和 ABCG2的蛋白表達水平。用1、2、5、10、20mg/ml的濃度順鉑(DDP)分別處理A549及細胞球48h后，用M TT檢測細胞

2、活力。
　　3、應(yīng)用比色法檢測10μM、50μM、100μM和200μMEA對 A549細胞球中GST活性的抑制作用。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測200μMEA處理A549細胞球48h后ROS水平。
　　4、應(yīng)用CCK-8檢測不同處理組（Control組、5mg/ml DDP組、200μM EA組和5mg/ml DDP+200μMEA組）干預(yù)A549細胞球后24h、36h和48h的細胞抑制率。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測不同處理組（同上）干預(yù)A

3、549細胞球48h后的凋亡率。在細胞成球?qū)嶒炛杏^察200μMEA處理后A549細胞球的成球能力。
　　5、應(yīng)用 Western blot和 qPCR檢測200uM EA處理 A549細胞球前后P＜atenin、Sox2和 ABCG2的 mRNA和蛋白水平；應(yīng)用熒光素酶報告基因檢測200uM EA處理A549細胞球前后β-catenin啟動子活性的變化情況。
　　6、用β-catenin腺病毒感染A549細胞球后，再用200μ

4、MEA的處理A549細胞球，應(yīng)用 qPCR和 Western blot檢測β-catenin、Sox2和 ABCG2 mRNA和蛋白的變化，并應(yīng)用CCK-8檢測上述處理后細胞抑制率的變化。
　　結(jié)果：
　　1、成功培養(yǎng)出懸浮的A549細胞球。
　　2、應(yīng)用Western blot檢測結(jié)果顯示A549細胞球高表達腫瘤干細胞標志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐藥相關(guān)蛋白ABCG2。應(yīng)用M TT檢測結(jié)果顯示A549細

5、胞球可耐受不同濃度DDP的殺傷作用。
　　3、應(yīng)用比色法檢測結(jié)果顯示GST活性隨著處理組E A濃度的遞增而逐漸降低。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示200pMEA處理A549細胞球后ROS水平明顯升高。
　　4、應(yīng)用CCK-8檢測結(jié)果顯示5mg/ml DDP組、200μMEA組和5mg/ml DDP+200μMEA組在24h、36h和48h的細胞抑制率均顯著高于Control組(p＜0.05)。此外，5mg/ml DDP+200μ

6、MEA組在24h、36h和48h時的細胞抑制率均高于5mg/ml DDP組和200μMEA組 A549細胞球在24h、36h和48h的細胞抑制率。流式細胞術(shù)檢測凋亡發(fā)現(xiàn)5mg/ml DDP+200μMEA組、5mg/ml DDP組和200μMEA較control組凋亡率顯著升高。細胞成球?qū)嶒炛?，EA抑制A549細胞球的成球能力。
　　5、應(yīng)用 Western blot和qPCR檢測結(jié)果顯示EA下調(diào)了 A549細胞球的β-caten

7、in、Sox2和 ABCG2 mRNA和蛋白的表達。應(yīng)用熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示EA抑制了β-catenin的啟動子活性。
　　6、應(yīng)用qPCR和 Western blot檢測結(jié)果顯示過表達β-catenin后，200μMEA對P-catenin、Sox2和 ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用較空載體組顯著減弱。應(yīng)用CCK-8檢測結(jié)果顯示過表達β-catenin可顯著削弱200uMEA聯(lián)合5mg/ml DDP對 A549細胞