Annexin a2與Stat3的相互作用在人乳腺癌中的功能研究.pdf

1、目的:
　　 膜聯(lián)蛋白Annexina2（以下簡稱Anxa2）是一種鈣依賴蛋白，廣泛高表達(dá)于各種癌組織中，在腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及粘附等功能中起多重作用。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，Anxa2能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-myc，CyclinD1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2，MMP-9的表達(dá)。這些蛋白都是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signaltransducerandactivatorof

2、transcription3，Stat3)的下游響應(yīng)因子。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，Anxa2和和Stat3間存在相互作用，但是Anxa2本身并沒有影響Stat3的表達(dá)水平。Anxa2與Stat3都是酪氨酸磷酸化蛋白，因此我們推測Anxa2可能通過自身的酪氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)Stat3的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控Stat3下游響應(yīng)蛋白因子的表達(dá)。本實驗應(yīng)用點突變技術(shù)，獲得Anxa2基因的持續(xù)激活和持續(xù)抑制的兩種突變體，通過感染/轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)蛋白

3、的細(xì)胞模型，在已有研究結(jié)果上進(jìn)一步探索Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化對于其自身活性及其調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲所起的作用，并為研究Anxa2與Star3相互作用的機制尋找新的線索。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用亞克隆技術(shù)，獲得表達(dá)Anxa2及其第23位酪氨酸的突變體的載體質(zhì)粒，pCDH-EGFP-Anxa2WT,pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。采用慢病毒感染以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

4、染技術(shù)，獲得表達(dá)Anxa2-WT及其突變體Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D的SK-BR-3及MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　 2.應(yīng)用MTT實驗檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的增殖能力的影響。
　　 3.應(yīng)用克隆形成實驗檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的克隆形成能力的影響。
　　

5、 4.應(yīng)用劃痕實驗檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對MCF-7細(xì)胞的體外遷移能力的影響。
　　 5.采用transwell小室體外遷移、侵襲實驗檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D對SK-BR-3和MCF-7細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力的影響。
　　 6.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)來檢測Stat3在乳腺癌患者的導(dǎo)管內(nèi)癌、浸潤性導(dǎo)管癌中的mRNA表達(dá)水平，并分析與Anxa2

6、mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　 7.采用免疫共沉淀技術(shù)檢測SK-BR-3細(xì)胞中Anxa2與Stat3的相互作用。
　　 8.應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A，和Anxa2-Y23D對周期相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)水平的影響。
　　 9.應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測Anxa2-WT,Anxa2-Y23A，和Anxa2-Y23D對Stat3在乳腺癌細(xì)胞

7、SK-BR-3細(xì)胞核和漿中的分布和激活的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.亞克隆技術(shù)獲得野生型的重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-EGFP-Anxa2WT，并獲得Anxa2的突變質(zhì)粒pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。
　　 2.重組/突變質(zhì)粒成功感染/轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7。
　　 3.野生型Anxa2-WT及其突變體Anxa2-Y23A，Anxa2-Y

8、23D在乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7中穩(wěn)定表達(dá)。
　　 4.免疫熒光檢測野生型Anxa2-WT主要定位于乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3和MCF-7中細(xì)胞膜和漿。
　　 5.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增強乳腺癌細(xì)胞的增殖與克隆形成能力。
　　 6.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D提高乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 7.Stat3mRNA在乳腺癌浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平明顯高于癌旁

9、組織(P＜0.0001)和導(dǎo)管內(nèi)癌(P＜0.0001)中的表達(dá);并與Anxa2mRNA在浸潤性導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá)具有相關(guān)性。
　　 8.免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Stat3與Anxa2在SK-BR-3細(xì)胞中存在相互作用。
　　 9.免疫印跡發(fā)現(xiàn)總裂解液中Anxa2-WT,Y23D對Stat3表達(dá)水平?jīng)]有影響，但是生長因子刺激后P-Stat3的表達(dá)水平有提高趨勢，而細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)則明顯提高。
　　 10.免疫