STAT3與GIV在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、前言:
　　 乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤,是全球女性因癌癥死亡的首要原因,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。致死原因大多是腫瘤細(xì)胞經(jīng)血道或淋巴道轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器管。其發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明。
　　 GIV是一個(gè)由1870或1871個(gè)氨基酸組成的分子量約220kD的細(xì)胞內(nèi)大分子,根據(jù)它們的亞基和亞細(xì)胞定位分為四個(gè)區(qū)域:N末端253個(gè)氨基酸編碼的與微管相互作用的Hook結(jié)構(gòu)域、88個(gè)氨基酸組成的介導(dǎo)同源二聚體形成的卷曲

2、螺旋結(jié)構(gòu)域、與Gi的a亞基相互作用的Ga結(jié)構(gòu)域(GBD)及與EGFR、Akt激酶和骨架蛋白相互作用的C末端組成。含Akt磷酸化位點(diǎn)的區(qū)域命名為CT1,其它的C末端區(qū)域命名為CT2。GIV的C末端的GEF結(jié)構(gòu)域是GIV的一個(gè)重要的組成部分,能特異性的結(jié)合和活化Gai亞基,活化的Gai釋放游離的Gbr亞基,通過Gbr-PI3K途徑增強(qiáng)Akt信號(hào)。Girdin通過CT1結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜有關(guān),CT2結(jié)構(gòu)域局限到肌動(dòng)蛋白纖絲上。GIV是磷脂酰肌醇3

3、-激酶(PI3-K)/AKT信號(hào)通路的一個(gè)新的組成元件,能夠增強(qiáng)Akt的磷酸化,激活的Akt能募集微絲蛋白形成片狀偽足,進(jìn)而影響細(xì)胞遷移。在細(xì)胞周期中,GIV在重塑肌動(dòng)蛋白骨架和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。GIV現(xiàn)已經(jīng)成為乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌的備受關(guān)注的生物標(biāo)記。
　　 STAT3是近期研究較多的一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子,并廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中。正常生理情況下,STAT3的激活是快速而短暫的,對(duì)維持細(xì)胞的生理功能調(diào)

4、節(jié)細(xì)胞增殖分化至關(guān)重要。已研究發(fā)現(xiàn)STAT3在頭頸部腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺腫瘤等多種惡性腫瘤組織與細(xì)胞系中有異常表達(dá)和活性增強(qiáng),提示STAT3異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡等功能的調(diào)控。持續(xù)性激活還將導(dǎo)致細(xì)胞失控性增生,加速血管生成,而在顱內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中,利用RNAi技術(shù)敲除STAT3基因則可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡表現(xiàn)。由此可以見STAT3是多種腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的接頭蛋白(a

5、daptorprotein),實(shí)施對(duì)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)必將對(duì)腫瘤的分化、增殖、凋亡以及血管生成產(chǎn)生重要影響。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn)GIV是與STAT3相互作用的蛋白質(zhì),具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。我們推測(cè)磷酸化的STAT3與GIV的關(guān)系更為密切,本文目的旨在探討乳腺組織及細(xì)胞系中STAT3與GIV表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)的意義,探討在乳腺癌中轉(zhuǎn)染、干擾STAT3功能后GIV表達(dá)的變化。
　　 材料與方法:
　　

6、1、材料
　　 204例乳腺組織標(biāo)本(包括43例正常乳腺組織,47例乳腺導(dǎo)管原位癌組織和114例乳腺浸澗性導(dǎo)管癌組織),均取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院2007-2010年腫瘤外科手術(shù)切除的標(biāo)本,所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定,石蠟包埋,HE常規(guī)染色后明確診斷。其中部分癌組織和正常乳腺組織離體后立即放入液氮后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2株乳腺癌癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MCF-7),1株人乳

7、腺正常上皮細(xì)胞系(MCF-10A)。用含10%新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。
　　 2、主要試劑和來源
　　 Stat3兔多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。P-Stat3和GIV兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignal公司和MilliporeInc,SP免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。引物購(gòu)自生工生物(上海)有限公司,RT-PCR、轉(zhuǎn)染、干擾

8、試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,引物購(gòu)自生工生物(上海)有限公司,RT-PCR、轉(zhuǎn)染、干擾試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
　　 3、方法
　　 (1)免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定
　　 標(biāo)本固定,石蠟包埋,制成4μm連續(xù)切片,采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測(cè)GIV和STAT3蛋白表達(dá)。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果判定:P-stat3以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯

9、色,GIV、STAT3以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。高倍視野(x400)下選陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí):淺黃色計(jì)為1分,棕黃色計(jì)為2分,黃褐色計(jì)為3分。按GIV和P-STAT3表達(dá)百分率分為以下四個(gè)等級(jí):0%為0分,1%-50%為1分,51%-75%為2分,＞75%為3分。以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的分值乘積作為每一例的積分,積分＜4者判定為陰性,積分＞4為陽(yáng)性。
　　

10、(2)WesternBlot
　　 在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,15000轉(zhuǎn)/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60μg。電泳(12%SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉,一抗GIV(1:200)、STAT3(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育過夜,分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗(1:4000)室溫孵育2小時(shí),ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀采集,進(jìn)行灰度值測(cè)定,

11、β-actin做內(nèi)參。
　　 (3)組織提取RNA及RT-PCR
　　 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,均按北京全式金公司RT-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行。(1)每100mg組織加1mlTrizol,冰浴下勻漿;(2)加2001.tl氯仿,充分混勻,室溫放置5分鐘;(3)120009,4。C,離心10分鐘;(4)取上清,加等體積異丙醇,充分混勻,室溫放置10分鐘;(5)120009.4。C,離

12、心10分鐘;(6)去上清,加75%乙醇1ml洗滌沉淀;(7)75009,4℃,離心5分鐘,去上清;(8)重復(fù)(6)～(7)步驟,超凈臺(tái)上揮發(fā)乙醇;(9)沉淀加適量的DEPC處理水,溶解總RNA后,-70℃保存?zhèn)溆?(10)總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280,兩者比值在1.8.2.0之問的RNA純度為好;(11)反轉(zhuǎn)錄使用Oligo(dT)弓1物,合成cDNA條件為:30。C,10分鐘;42℃,30分鐘;99℃,5分鐘;5

13、℃,5分鐘。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20p.1。PCR引物經(jīng)GeneBank上的Blast比對(duì)后委托上海生工公司合成,PCR引物序列和反應(yīng)條件等詳細(xì)信息見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖,100伏電泳30分鐘,EB染色,凝膠成像系統(tǒng)(BioImagingSystem,UVP'USA)觀察。以β-actin為內(nèi)對(duì)照。
　　 (4)siRNA轉(zhuǎn)染、干擾
　　 實(shí)驗(yàn)分三組:空白對(duì)照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染

14、組和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,轉(zhuǎn)染具體步驟按Lipofeet2000試劑說明書進(jìn)行。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,對(duì)P-stat3和GIV表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系用x2檢驗(yàn);P-stat3和GIV表達(dá)的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,采用t檢驗(yàn)分析Westernblot圖像灰度值。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組織化學(xué)結(jié)

15、果
　　 P-stat3蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá),GIV蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)。在乳腺癌發(fā)生過程(正常乳腺組織,導(dǎo)管原位癌,浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌)中Ps-tat3和GIV蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢(shì)。兩者表達(dá)水平均與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)(P＞0.05)無關(guān),GIV與ER(P＜0.05)、PR(P＜0.05),與her-2(P＜0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)明顯相關(guān)。在114例乳腺癌中P-stat3和GIV蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)

16、。
　　 2、RT-PCR和WesternBlot結(jié)果
　　 P-stat3蛋白和GIV蛋白在乳腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織及細(xì)胞系,用STAT3轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB231中Stat3的功能
　　 后GIV的mRNA和蛋白水平較對(duì)照組增強(qiáng);siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB231中Stat3的功能后GIV的mRNA和蛋白水平較對(duì)照組下降。
　　 結(jié)論: