GRIM-19和STAT3在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性.pdf

1、研究背景:
　　GRIM-19(Gene associated with Retinoid-Interferon-induced Mortality19，干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19)是Kalvakolanu用反義RNA敲除技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞篩選鑒定并首先報(bào)道的凋亡蛋白。GRIM-19定位于19p13.2，其編碼含144個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約16KD。GRIM-19定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體。GRIM-1

2、9的過度表達(dá)激活細(xì)胞的凋亡過程，其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。同時(shí)，GRIM-19又是線粒體呼吸鏈中NADH脫氫酶復(fù)合體Ⅰ的基本亞單位，在呼吸過程中起著重要的作用。
　　STAT3(Signal transducer and activator of transcription-3)是一種存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號(hào)通道偶聯(lián)的雙功能蛋白。研究表明STAT3在多數(shù)腫瘤中處于持續(xù)激活狀態(tài)，并上調(diào)抗凋亡基因的表

3、達(dá)。GRIM-19是STAT3表達(dá)和激活的陰性調(diào)節(jié)因子，能夠下調(diào)STAT3及其下游靶基因的表達(dá)，繼而參與腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　研究目的:
　　通過分析GRIM-19及其靶基因產(chǎn)物STAT3在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況，探討GRIM-19及STAT3在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性。
　　研究方法:
　　選擇山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2011年7月-2013年9月收治的93例乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織。年齡39-65歲，中位

4、年齡為48.5歲。標(biāo)本采集后，立即置入液氮冷凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。其中，采用Western blot、免疫組織化學(xué)（SP法）檢測2011年7月-2012年1月所收集20組標(biāo)本中GRIM-19、STAT3蛋白的表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR檢測2013年4月-2013年9月收集的73組標(biāo)本中GRIM-19、STAT3 mRNA的表達(dá)。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)，包括ER、PR、HER-2/neu、Ki-67、P53等。所有診斷均經(jīng)病理

5、檢查證實(shí)。
　　1、Western blot檢測
　　步驟:適量組織加入50μl RIPA（臨用前加入PMSF、抑蛋白酶肽）冰上30min，4℃12000rpm/min離心10min，移上清至一新的微量離心管，蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5％脫脂奶粉配制1×TBST20℃封閉2h，GRIM-19一抗按1∶500反應(yīng)4℃過夜，TBST洗膜10min×3次，GRIM-19二抗按1∶1500反應(yīng)2h

6、，TBST洗膜10min×3次;STAT3一抗按1∶5000反應(yīng)4℃過夜，TBST洗膜10min×3次。STAT3二抗按1∶2000反應(yīng)2h，TBST洗膜10min×3次;β-actin一抗按1∶1500反應(yīng)4℃過夜，TBST洗膜10min×3次，β-actin二抗按1∶1500反應(yīng)2h，TBST洗膜10min×3次。ECL顯影并處理圖像。
　　2、免疫組化檢測
　　(1)免疫組化過程將收集到的乳腺癌組織及癌旁組織應(yīng)用甲醛溶

7、液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片;脫蠟水化，3％過氧化氫浸泡10min，微波修復(fù)(GRIM-19采用pH6.0檸檬酸，STAT3采用pH8.0EDTA)，中高火10min，中低火10min，冷卻至室溫;滴加血清封閉，37℃孵育30min，后滴加一抗，37℃孵育90min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育20min，沖洗，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物工作液，37℃孵育20min，沖洗后DAB法顯色，

8、復(fù)染封片。一抗試劑選用Santa Cruz公司鼠抗人多克隆抗體GRIM-19(sc-99086，1∶100 dilution.Santa Cruz，CA)、兔抗人單克隆抗體STAT-3(Cell SignalingTechnology,1∶100 dilution.Beverly, MA)、二硝基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自SantaCruz，CA。STAT3陽性對(duì)照采用已經(jīng)報(bào)道過表達(dá)陽性的肺鱗癌組織，GRIM-19陽性對(duì)照采用正常人的胰

9、島組織。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。
　　(2)免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) GRIM-19和STAT3免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)組織細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例以及染色深度進(jìn)行綜合評(píng)分。按照陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分:陽性細(xì)胞所占比例為隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞≤10％記為0分，11％-25％為1分，＞25％-50％為2分，＞50％為3分。染色深度:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩個(gè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的乘積作為該標(biāo)本的積

10、分，≤2分為陰性，＞2分為陽性[1]。
　　3、Real-time PCR檢測
　　(1)組織的獲取與裂解用生理鹽水將組織標(biāo)本沖洗1-2次，用TRIZOL法提取mRNA，并測定mRNA濃度。
　　(2)逆轉(zhuǎn)錄配置逆轉(zhuǎn)錄體系，混勻，反應(yīng)條件:第一步，37℃20min;第二步，85℃5s;第三步，4℃forever;第四步，stop。
　　(3) Real Time PCR(20μ1體系)10μl SYBR,0.2μ

11、l PCR F Primer,0.2μlPCR R Primer，2.0μl cDNA模板，7.6μl3dw滅菌。反應(yīng)條件:95℃30s，Holdingstage;95℃5s,55.0℃30s,39 cycles;95.0℃15s,60.0℃1min,90℃15s, Meltcurve stage。
　　研究結(jié)果:
　　一、GRIM-19與STAT3在乳腺癌組及癌旁組中的表達(dá)水平及相關(guān)性
　　1、Western blo

12、t檢測結(jié)果顯示GRIM-19與STAT3蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，但GRIM-19蛋白在乳腺癌組中的表達(dá)低于癌旁組織(P＜0.001);STAT3蛋白在乳腺癌組中的表達(dá)高于癌旁組(P＜0.001)。且在90％(18/20)患者的乳腺癌組織中，同時(shí)呈現(xiàn)GRIM-19蛋白的低表達(dá)與STAT3蛋白的高表達(dá)，兩者蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.68，P＜0.001）。
　　2、免疫組化（SP法）檢測結(jié)果顯示GRIM-19蛋白在乳腺

13、癌組中的陽性率低于癌旁組（x2=12.13，P＜0.001）。STAT3蛋白在乳腺癌組中的陽性率高于癌旁組（x2=4.91，P=0.027）。且在65％(13/20)患者的乳腺癌組織中，同時(shí)呈現(xiàn)GRIM-19蛋白的低表達(dá)與STAT3蛋白的高表達(dá)，兩者蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.49，P=0.028)。
　　3、RT-PCR檢測結(jié)果顯示GRIM-19與STAT3 mRNA在乳腺癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，但GRIM-19 mRNA在

14、乳腺癌組中的表達(dá)低于癌旁組(P＜0.001);STAT3 mRNA在乳腺癌組中的表達(dá)高于癌旁組(P＜0.001)。且在68％(50/73)患者的乳腺癌組織中，同時(shí)呈現(xiàn)GRIM-19 mRNA的低表達(dá)與STAT3mRNA的高表達(dá)，兩者mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.60，P＜0.001）。
　　二、乳腺癌組織中GRIM-19與STAT3的表達(dá)水平與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系
　　1、分析乳腺癌組織中GRIM-19與STAT3蛋白在Wes

15、tern blot方法中的檢測結(jié)果與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示HER-2/neu陽性組中GRIM-19蛋白的表達(dá)低于HER-2/neu陰性組(P=0.037)，ER陽性組中STAT3蛋白的表達(dá)高于ER陰性組(P=0.030)。
　　2、分析乳腺癌組織中GRIM-19與STAT3 mRNA的表達(dá)與病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示:
　　(1) GRIM-19 mRNA在乳腺癌組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)組中高表達(dá)率低于Ⅰ/Ⅱ級(jí)組(P=0.026)

16、;同時(shí)，Ⅲ級(jí)組中STAT3的mRNA高表達(dá)率高于Ⅰ/Ⅱ級(jí)組(P=0.021)。
　　(2) GRIM-19 mRNA的表達(dá)與Ki-67呈負(fù)相關(guān)（r=-0.414，P＜0.05），即GRIM-19 mRNA表達(dá)降低時(shí)，Ki-67陽性率升高;相反，STAT3mRNA的表達(dá)與Ki-67呈正相關(guān)(r=0.898，P＜0.05)，STAT3 mRNA表達(dá)升高時(shí)，Ki-67陽性率也升高。
　　(3) STAT3 mRNA在腋窩淋巴結(jié)陽性