ClC-7引起牙缺失的動物實驗研究.pdf

1、在罕見的遺傳性骨病-骨硬化癥病例中，CLCN7基因發(fā)生了突變，患者表現(xiàn)為全身彌漫性骨密度增高，其核心機制是當ClC-7功能障礙時破骨細胞不能正常發(fā)揮作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CLC-7蛋白表達于小鼠胚胎及出生后1天的小鼠牙胚中，并且一些骨硬化癥患者口腔表現(xiàn)為牙齒缺失，未萌出，牙根發(fā)育停止，且有牙釉質(zhì)發(fā)育不全表現(xiàn)，Clcn7基因敲除小鼠也表現(xiàn)為牙不萌出。ClC-7功能障礙出現(xiàn)的這些牙異常是由于破骨細胞異常直接造成的還是由于 ClC-7直接參

2、與了牙胚發(fā)育的調(diào)控尚不清楚，本研究擬采用腎被膜移植牙胚的方法，模擬一個缺乏破骨細胞的環(huán)境使牙胚在此環(huán)境中的生長，通過Clcn7 shRNA慢病毒感染、降低牙胚Clcn7基因的表達，從而觀察牙胚生長的情況。
　　方法：
　　1.Clcn7 shRNA慢病毒的制備及牙胚感染慢病毒體系的建立。取E13.5天Balb/c小鼠的下頜第一磨牙牙胚，用帶 GFP綠色熒光的 shRNA慢病毒將其感染，連續(xù)4天觀察感染后牙胚熒光表達情況，以確

3、定最佳的感染復數(shù)（MOI）。在確定了最佳感染復數(shù)后，用針對Clcn7 shRNA慢病毒感染牙胚后，提取牙胚組織RNA，進行實時定量PCR實驗，驗證對Clcn7的基因沉默效果。
　　2.Clcn7基因沉默對牙形態(tài)的影響。將感染Clcn7 shRNA慢病毒的牙胚移植于同種雄性成年小鼠的腎被膜下，4周后處死宿主小鼠，取出移植塊，進行 micro-CT掃描，觀察牙齒形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。將牙胚移植塊進行石蠟切片、H&E染色及AZON染色，觀察牙

4、齒各個結(jié)構(gòu)如牙根、牙本質(zhì)、牙周組織等的改變，觀察 Clcn7對牙齒發(fā)育的影響。
　　3.Clcn7基因沉默對牙相關(guān)蛋白表達的影響。采用免疫組化方法進一步研究ClC-7及DSP的表達，初步判斷ClC-7對牙發(fā)育影響的可能機制。另外選取成牙本質(zhì)細胞MDPC-23細胞系作為研究對象，進行Clcn7 siRNA轉(zhuǎn)染，提取細胞mRNA，利用實時定量PCR實驗觀察Clcn7及Dspp的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.Clcn7 s

5、hRNA慢病毒對牙胚的感染復數(shù)（MOI）為5000TU/每個牙胚，感染時間為24小時。在這種條件下，感染效果最好，綠色熒光表達最強。
　　2.牙胚感染Clcn7shRNA慢病毒后，用牙胚組織提取RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA做實時定量PCR結(jié)果顯示，實驗組比陰性對照組Clcn7的表達降低了70％（P<0.05）。
　　3.Clcn7 shRNA慢病毒感染牙胚后，將牙胚移植于腎被膜下4周后 micro-CT掃描結(jié)果顯示，空白對照組

6、及陰性對照組牙齒發(fā)育完好，結(jié)構(gòu)完整，牙根發(fā)育正常，牙尖輪廓清晰，實驗組牙齒畸形，牙根彎曲或變短，牙尖結(jié)構(gòu)不明顯。
　　4.牙齒石蠟切片H&E染色及AZON染色結(jié)果顯示，空白對照組及陰性對照組牙齒結(jié)構(gòu)完整，前期牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，牙周組織結(jié)構(gòu)正常，其牙周韌帶、牙骨質(zhì)及牙槽骨結(jié)構(gòu)正常、清晰。而實驗組部分前期牙本質(zhì)變寬，牙根彎曲，牙周組織中正常的牙周韌帶、牙骨質(zhì)及牙槽骨消失，充滿了排列紊亂的成纖維細胞。
　　5.石蠟切片免疫組織化學染

7、色結(jié)果顯示，CLC-7及DSP表達于成牙本質(zhì)細胞及前期牙本質(zhì)，與空白對照組及陰性對照組相比，實驗組CLC-7的表達未見明顯降低，而DSP表達明顯降低。
　　6.成牙本質(zhì)細胞MDPC-23細胞系實時定量PCR結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，Clcn7 siRNA實驗組Clcn7的表達明顯降低，而Dspp的表達未發(fā)生改變。
　　結(jié)論：
　　1.無論是在牙胚組織還是成牙本質(zhì)細胞MDPC-23細胞系中，Clcn7 shRNA慢病毒

8、或siRNA可有效地沉默Clcn7基因，降低ClC-7的表達。
　　2.采用腎被膜下移植牙胚的方法，模擬一個缺乏破骨細胞的環(huán)境，使牙胚在此環(huán)境中生長，從而觀察 ClC-7在牙齒發(fā)育中所起的作用，同時也驗證了腎被膜下微環(huán)境對牙齒發(fā)育的可行性，為牙胚的生長及發(fā)育提供了極好的環(huán)境。
　　3. CLC-7表達于前期牙本質(zhì)及成牙本質(zhì)細胞。
　　4. ClC-7在牙胚的發(fā)育中具有重要的作用，可影響牙齒的形態(tài)，牙根的發(fā)育，牙本質(zhì)的發(fā)