軟骨細(xì)胞中靶向敲除shp2引起混合性軟骨瘤

1、軟骨細(xì)胞中靶向性干擾軟骨細(xì)胞中靶向性干擾Shp2引起混合性軟引起混合性軟骨瘤伴多發(fā)軟骨突起骨瘤伴多發(fā)軟骨突起ABSTRACT混合性軟骨瘤是一種良性骨病，主要見(jiàn)于兒童或青年人的手足部，有兩種不同的表現(xiàn)：在骨表面一種軟骨覆蓋的骨質(zhì)過(guò)度生長(zhǎng)稱為外生骨疣，骨內(nèi)部的異位軟骨樣結(jié)節(jié)稱為內(nèi)生軟骨疣。最近，有報(bào)道SHP2基因，一種編碼SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶的基因，其功能喪失性突變與混合性軟骨瘤有關(guān)。本研究旨在探究SHP2在出生后軟骨發(fā)育過(guò)程中的作用，

2、這種作用目前還很不了解。我們?cè)谛∈蟀l(fā)育過(guò)程中的出生后階段，按軟骨細(xì)胞特異性手段，利用他莫昔芬誘導(dǎo)系統(tǒng)干擾Shp2。我們發(fā)現(xiàn)在第一次誘導(dǎo)后一個(gè)月內(nèi)手足部出現(xiàn)腫瘤樣結(jié)節(jié)。經(jīng)X光和CT分析發(fā)現(xiàn)，SHP2缺乏小鼠在手足和肋部多塊骨骼處表現(xiàn)出外生骨疣樣和內(nèi)生軟骨疣樣表型。組織學(xué)評(píng)估顯示生長(zhǎng)板軟骨，來(lái)自骨骺的一塊軟骨性突起，缺乏組織結(jié)構(gòu)，并且骨內(nèi)有異位軟骨結(jié)節(jié)，這與人類(lèi)中的混合性軟骨瘤的病理學(xué)特點(diǎn)相符合（即同時(shí)有外生骨疣和內(nèi)生軟骨疣）。在分子層面上

3、，我們?cè)赟HP2缺乏小鼠的受累軟骨結(jié)節(jié)中觀察到IndianHedgehog蛋白（IHH）及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）大量表達(dá)，而有絲分裂活化蛋白激酶（MAPK）表達(dá)受損。總而言之，我們做出了一個(gè)混合性軟骨瘤的小鼠模型，該模型包括外生骨疣和內(nèi)生軟骨疣的特征。本研究為該病的病理生理研究提供了新的模型，并推進(jìn)了對(duì)混合性軟骨瘤的理解。該模型對(duì)識(shí)別該病病因和病程中的分子機(jī)制十分有用，同時(shí)也可用于將來(lái)開(kāi)發(fā)新的治療措施。INTRODUCTION

4、混合性軟骨瘤（MC，OMIM156250）是一種主要見(jiàn)于兒童和青年人的疾病，患者出現(xiàn)良性骨腫瘤形成腫塊，影響骨骼的生長(zhǎng)，最常見(jiàn)于手足部。本病為常染色體顯性，特點(diǎn)是常累及手足部骨骼（即指骨和掌骨跖骨）的外生骨疣（即從骨表面出現(xiàn)良性骨質(zhì)生長(zhǎng)），以及長(zhǎng)骨干骺端和髂嵴的內(nèi)生軟骨疣（1，2）。經(jīng)典的多發(fā)性外生骨疣就是人們已知的多發(fā)性遺傳性外生骨疣（MHE，OMIM:133700）（3），它在臨床上與混合性軟骨瘤是不同的，因?yàn)槭肿闶芾凼腔旌闲攒浌橇?/p>

5、的標(biāo)準(zhǔn)，但在經(jīng)典的多發(fā)性外生骨疣中少見(jiàn)（4）。另外，MHE患者不會(huì)發(fā)生內(nèi)生軟骨疣。但是，混合性軟骨瘤與經(jīng)典多發(fā)性外生骨疣疾病機(jī)制上的差別目前仍不清楚。最近，人類(lèi)基因研究利用全基因組測(cè)序和連鎖分析揭示出SHP2種系失活突變與混合性軟骨瘤之間有關(guān)系（1，2）。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，即11型蛋白酪氨酸非受體（PTPN11），在某些受體酪氨酸激酶下游的RAS有絲分裂活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)傳遞中起核心作用，這些受體酪氨酸激酶包括表皮生長(zhǎng)

6、因子受體（EGFR）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）（5，6）。一般來(lái)說(shuō)，SHP2促進(jìn)生長(zhǎng)因子受體下游的RASMAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（6，7）。SHP2廣泛表達(dá)，特別是在腦部（8），涉及到多種細(xì)胞類(lèi)型的分化和組織的形成（9）。同源SHP2小鼠在孕中期即發(fā)生胚胎死亡，這是由多種原腸胚形成和中胚層形成缺陷所致（10）。不過(guò)，SHP2在骨骼發(fā)育中起的作用大部分還是不清楚的。在我們的前期工作中，我們?cè)诔錾笮∈篌w內(nèi)的體細(xì)胞中除去了Shp2基因，并

7、發(fā)現(xiàn)了多種了骨骼異常，包括脊柱側(cè)凸，脊柱后凸，骨骼石化病，以及生長(zhǎng)板紊亂伴軟骨異常（11）。在這些誘導(dǎo)性SHP2缺乏小鼠中，已知生長(zhǎng)板出現(xiàn)紊亂，我們假定這種紊亂對(duì)于特異性研究SHP2在出生后軟骨發(fā)育和重構(gòu)期軟骨細(xì)胞中的原的細(xì)胞中（即軟骨細(xì)胞）特異性刪除。但是，我們觀察到在本病發(fā)生的早期階段，骨膜和軟骨膜中呈Xgal陽(yáng)性染色（即有Cre活性）（SupplementalFig.S2）。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種可能性，即骨膜或軟骨膜中缺乏Shp2的

8、軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞引起了異位軟骨形成，就如同在人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的含成軟骨性祖細(xì)胞的骨膜和軟骨膜中所報(bào)道的那樣。在Cre活性效率方面，值得注意的是軟骨結(jié)節(jié)病變區(qū)有Xgal陰性軟骨細(xì)胞（SupplementalFig.S2）。與之相比，在結(jié)節(jié)中IHH和FGF2都大量表達(dá)（Fig.6）。目前仍不清楚本病的機(jī)制，但我們認(rèn)為本病的發(fā)生與發(fā)展既有細(xì)胞自主性模式，也有非細(xì)胞自主性模式。最近有個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)，在EXT1條件性敲除小鼠模型中，只需要有6~15%

9、的Cre重組即足以出現(xiàn)異位軟骨形成。我們的這些證據(jù)與這個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)相一致，提示有這樣一種可能，一小部分軟骨細(xì)胞中目標(biāo)基因的失活即足以影響周?chē)钠渌浌羌?xì)胞從而產(chǎn)生明顯的表型變化（19）。另外，若我們只注射一次他莫昔芬時(shí)，就會(huì)觀察到本病的早期階段，而沒(méi)有晚期階段。因此，我們認(rèn)為多次他莫昔芬注射帶來(lái)的非細(xì)胞自主性機(jī)制可能對(duì)本病的進(jìn)展十分重要。有趣的是，小鼠中混合性軟骨瘤表型的發(fā)展十分依賴于SHP2刪除的時(shí)間。本研究中，我們?cè)?周齡時(shí)誘導(dǎo)Sh

10、p2基因破壞（即小鼠未成熟期），并觀察到指骨末端在6~8周時(shí)出現(xiàn)表型（即手足部），隨時(shí)間發(fā)展到12周。但是，我們?cè)谂咛テ诨虺赡昶冢?周以后）小鼠中誘導(dǎo)刪除SHP2后，并沒(méi)有觀察到這種表型，盡管這些時(shí)期Cre活性被誘導(dǎo)。另外，我們?cè)诘?周時(shí)誘導(dǎo)基因破壞時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IHH和Erk有任何變化，這可能與混合性軟骨瘤表型缺失有關(guān)系。與此一致的是，在我們之前的研究中曾經(jīng)在6~8周范圍內(nèi)廣泛誘導(dǎo)基因破壞，沒(méi)有觀察到混合性軟骨瘤表型（11）。因此，我們

11、相信SHP2可能在軟骨中起一種年齡依賴性作用，這可能是因?yàn)榇嬖谝环N或數(shù)種年齡依賴性輔因子或代償機(jī)制。這種年齡依賴性現(xiàn)象，與人們已知的混合性軟骨瘤是一種出生后兒科疾病而非先天性疾病或成年期疾病相符合。要研究這種有趣的發(fā)現(xiàn)尚需更多研究。已知多發(fā)性遺傳性外生骨疣（MHE）屬于經(jīng)典的外生骨疣，主要起因是EXT1基因和EXT2基因突變（3，23），這兩個(gè)基因編碼一種糖基轉(zhuǎn)移酶，它對(duì)硫酸乙酰肝素的合成是必需的。MHE外生骨疣通常位于肱骨近側(cè)，橈骨和

12、尺骨遠(yuǎn)側(cè)，脛骨近側(cè)，以及股骨遠(yuǎn)側(cè)的干骺區(qū)域，而混合性軟骨瘤中的外生骨疣位于指骨的干骺區(qū)域（即手足部）。MHE外生骨疣一般情況下被一層發(fā)育良好的軟骨帽覆蓋，伴有內(nèi)生軟骨疣形成，而混合性軟骨瘤中的外生骨疣被一層纖維帽覆蓋，沒(méi)有內(nèi)生軟骨疣形成（Fig.4）。另外已經(jīng)知道有些MHE患者EXT1和EXT2的基因測(cè)試是陰性（24），提示涉及了其它未知的分子成為MHE的致病基因。與我們的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，一種成軟骨細(xì)胞至少是MHE的病因細(xì)胞類(lèi)型之一，因?yàn)樵谛?/p>

13、鼠軟骨細(xì)胞中靶向刪除EXT1顯示出了MHE表型（19）?；旌闲攒浌橇龊蚆HE都表現(xiàn)出干骺端的異位骨生長(zhǎng)。有一種可能，骨膜中的成軟骨細(xì)胞參與了初始的軟骨形成。作為未來(lái)的方向，比較混合性軟骨瘤和MHE之間外生骨疣的病理機(jī)制將會(huì)十分有意思?；旌闲攒浌橇鲈诨颊咧锌赡苁怯羞z傳異質(zhì)性的（1）。不過(guò)，我們僅僅在純合SHP2cKO小鼠中觀察到類(lèi)似混合性軟骨瘤的表型。有可能體細(xì)胞第二次突變引起了人類(lèi)的混合性軟骨瘤，因?yàn)橐阎猄HP2是一種重要的腫瘤抑制因子

14、（25）。要在患者身上證明這種設(shè)想可能很困難，因?yàn)殡y以取得患者樣本。值得注意的是人類(lèi)SHP2基因的種系突變也可能引起Noonan綜合征（OMIM163950）和LEOPARD綜合征（OMIM151100），這兩種綜合征都有骨骼成分（6，7，26，27）。不過(guò)，在這些疾病中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)混合性軟骨瘤，提示對(duì)于本病的發(fā)展，需要SHP2在軟骨細(xì)胞中的特異性缺失。本研究的局限在于本病的病因后果機(jī)制在分子水平上仍然不清楚。異位軟骨結(jié)節(jié)中IHH過(guò)量表達(dá)，