家蠶成品卵微孢子蟲McAb-ELISA檢測方法的研究.pdf

1、家蠶微粒子病(Pebrine disease)是由家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis簡稱Nb)寄生而引起家蠶疾病，是一種分布很廣的傳染性蠶病，由于其特殊的經(jīng)卵傳染方式，對蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴重威脅，也是蠶種生產(chǎn)上唯一的檢疫對象。目前生產(chǎn)上實行母蛾檢驗制度，淘汰有毒母蛾所產(chǎn)蠶卵，以供應“無毒"蠶種，從而保障了蠶業(yè)生產(chǎn)的安全。而成品卵檢驗檢疫作為“補正檢查”的方式，近幾年也得到廣泛關注和作為農(nóng)業(yè)部標準的備檢項目，現(xiàn)行生產(chǎn)中的母蛾檢驗和成

2、品卵檢驗主要用光學顯微鏡進行的。隨著科學技術的進步和生產(chǎn)實際需要，應用現(xiàn)代分子生物學技術和免疫學技術進行家蠶微粒子病檢測實用技術的開發(fā)，也是業(yè)內(nèi)十分關注的問題?？诎断到y(tǒng)對進出口蠶種承擔著較大的責任，目前采用的仍然是顯微鏡鏡檢法，存在一定風險。研究開發(fā)一種基于免疫學技術，能用于家蠶產(chǎn)品進出口中家蠶微粒子病檢疫的方法是必要的。 抗Nb孢子表面蛋白的多抗識別抗原表位多，但與單抗相比，存在交叉反應和靈敏度低等問題。本試驗利用多抗識別抗原

3、表位較多、容易捕獲孢子和單抗對Nb孢子特異性較強的特點，通過將酶直接標記于單克隆抗體上，意圖獲得一種簡單實用的雙抗體夾心ELISA檢測方法。 用純化的家蠶微孢子蟲抗兔多抗包被，作為捕獲抗原，加入檢測樣品，然后用辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體作為檢測抗原，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，并對各步實驗條件進行優(yōu)化。 研究表明，用液氮凍融加研磨的方法對微孢子蟲進行處理后，包被效果顯著提高。制備的單抗經(jīng)western blot

4、ting驗證，識別的是孢子的表面抗原。多抗最適包被濃度為10μg/ml，最適包被條件為4℃過夜，酶標二抗工作濃度為1:2 000，待檢樣品和酶標二抗的反應時間分別為37℃ 1.5h和1h，底物于37℃顯色15min。 用所建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法進行了靈敏度檢測，結果顯示：對純化孢子的檢測量為3.125×105 spores/ml，對“添毒"蠶卵的檢測量為5×106 spores/ml?？梢杂糜趯嶋H生產(chǎn)中的檢測，靈敏度