家蠶微孢子蟲Met-AP2基因驗證與煙曲霉素治療效果檢測.pdf

1、微孢子蟲可以感染幾乎所有動物，包括大多數(shù)的昆蟲，微孢子蟲和微孢子蟲病的研究一直是病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。家蠶微孢子蟲病既可以通過水平傳播，也可以經(jīng)胚胎傳播，威脅著各養(yǎng)蠶國家的蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，因此家蠶微孢子蟲病是蠶業(yè)生產(chǎn)上最重要的檢疫防控對象。自從在人腸道微孢子蟲病治療研究中發(fā)現(xiàn)煙曲霉素及其衍生物、類似物均具有明顯的治療效果，且作用的靶位點是Met-AP2基因，這為家蠶微孢子蟲病的治療機(jī)理研究提供了方向。故本課題擬在家蠶微孢子蟲基

2、因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選尋找家蠶微孢子蟲Met-AP2基因的存在基礎(chǔ)上，嘗試應(yīng)用對人微孢子蟲病治療有效的藥物煙曲霉素對家蠶微孢子蟲病進(jìn)行模擬治療研究，探討藥物處理前后在人工感染家蠶微孢子蟲的家蠶組織中微孢子蟲Met-AP2基因的變化規(guī)律，以期為家蠶微孢子蟲病的治療提供實驗參考和理論依據(jù)。
　　本論文在課題組前期開展家蠶微孢子蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組（廣東株）研究基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法篩選出與煙曲霉素藥物治療相關(guān)靶基因Met-AP2進(jìn)行

3、了PC R測序驗證及檢測應(yīng)用研究，并對其基因功能及其在家蠶組織中的不同侵染階段的表達(dá)功能等進(jìn)行了分析研究，旨在為家蠶微孢子蟲病有效治療提供分子依據(jù)。
　　結(jié)果如下：
　?。?）家蠶微孢子蟲Met-AP2基因的驗證及生物信息學(xué)分析
　　在對家蠶微孢子蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中推斷的Met-AP2基因進(jìn)行PC R克隆測序驗證，經(jīng)不同引物測序驗證發(fā)現(xiàn)相似性都在93％以上，其中MC-F/R引物測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似性高達(dá)99.9%；以

4、引物MC-F/R，2047F/R對其他家蠶常見病原微生物及4種昆蟲微孢子蟲中 Met-AP2基因的特異性，敏感性進(jìn)行 PCR鑒別，并以引物 MC-F/R對相應(yīng)片段進(jìn)行克隆測序分析。發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲（廣東株）只存在一個Met-AP2基因，開放閱讀框1077 bp，共編碼358個氨基酸，其編碼蛋白的分子量約為45kDa，為疏水的穩(wěn)定蛋白。Met-AP2基因序列上沒有預(yù)測的信號肽糖基化位點及跨膜結(jié)構(gòu)域，其蛋白結(jié)構(gòu)中存在典型的α–he lix元

5、件。
　　（2）建立了原核重組質(zhì)粒pET-28a–me t
　　使用 pET-28a載體，Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，對 Met-AP2進(jìn)行原核表達(dá)，并通過SDS-PAGE和Western blot驗證其分子量為45KDa，與預(yù)測結(jié)果相符。對融合蛋白進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析純化后得到純度較高的蛋白。
　　（3）家蠶微孢子蟲煙曲霉素治療效果驗證及Met-AP2靶基因應(yīng)用
　　對正常家蠶、感病家蠶、只添食藥物煙曲霉素家蠶和

6、感病后煙曲霉素治療的家蠶進(jìn)行了比較觀察，發(fā)現(xiàn)添食藥物之后的家蠶表面無明顯的病斑。同時篩選了5對以Met-AP2基因為靶基因的LAMP引物，選了其中一個效果較好的引物 LM1，優(yōu)化了合適的內(nèi)外引物配比和擴(kuò)增溫度，創(chuàng)新地建立一套基于Met-AP2基因的家蠶微孢子蟲LAMP檢測方法。同時通過對添食藥物前后不同時期中腸組織的進(jìn)行了LAMP檢測，從分子水平上驗證了煙曲霉素治療家蠶微孢子蟲病的效果，為生產(chǎn)上推進(jìn)應(yīng)用煙曲霉素藥物治療家蠶微孢子蟲病提供