蛋白磷酸酯酶2A的活性下調(diào)對(duì)戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠癇性發(fā)作及海馬苔蘚纖維出芽的促進(jìn)作用.pdf

1、第一部分 p-tau(Ser262)蛋白在戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬中的表達(dá)變化及其在海馬苔蘚纖維出芽中的作用研究
　　目的:檢測(cè)和分析p-tau(Ser262)及其總tau蛋白在戊四氮點(diǎn)燃顳葉癲癇模型大鼠海馬中的表達(dá)變化，并探討其在海馬苔蘚纖維出芽中的作用。
　　方法:150只6-8周齡健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和戊四氮組，它們?cè)匐S機(jī)分為3天、1周、2周、4周、6周五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的亞組，采用戊四氮(30mg/kg)持續(xù)腹腔注

2、射的方法，建立戊四氮點(diǎn)燃顳葉癲癇模型，相應(yīng)的對(duì)照組給予生理鹽水持續(xù)腹腔注射，于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。每次給藥后至少觀察2小時(shí)，并用照相儀記錄大鼠發(fā)作情況，以評(píng)價(jià)造模成功與否。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)p-tau(Ser262)及總tau在對(duì)照組及戊四氮組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬中的表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)p-tau(Ser262)及總tau在對(duì)照組及戊四氮組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬表達(dá)量的變化;熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證總tau mRNA的表達(dá)變化;

3、Timm染色檢測(cè)對(duì)照組及戊四氮組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬苔蘚纖維出芽動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果:
　　1.建立了戊四氮點(diǎn)燃顳葉癲癇模型，取得了實(shí)驗(yàn)所需組織標(biāo)本。
　　2.戊四氮組免疫組化結(jié)果顯示p-tau(Ser262)的表達(dá)水平除3天組外均顯著增高(p＜0.001)，表現(xiàn)為1周時(shí)間點(diǎn)開始表達(dá)升高，隨給藥次數(shù)的增多表達(dá)逐漸升高，4周時(shí)達(dá)到高峰，6周時(shí)表達(dá)下降至約相當(dāng)于2周時(shí)水平，而總tau蛋白在戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬的表達(dá)與正常對(duì)照

4、組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了p-tau(Ser262)在戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬中的表達(dá)變化，而熒光定量PCR亦證實(shí)戊四氮組總tau在其mRNA水平即與對(duì)照組無顯著差別(p＞0.05)。
　　3.Timm染色結(jié)果顯示除3天組外戊四氮組余各時(shí)間點(diǎn)的苔蘚纖維出芽與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01)，出芽程度隨著給藥次數(shù)的增加而升高，4周時(shí)達(dá)高峰，之后維持于該水平。苔蘚纖維出芽在各

5、時(shí)間點(diǎn)的程度變化與p-tau(Ser262)在癲癇大鼠海馬中的表達(dá)模式呈高度一致性，提示p-tau(Ser262)在海馬苔蘚纖維出芽中可能發(fā)揮重要作用。
　　結(jié)論:
　　海馬苔蘚纖維出芽可能是戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠癇性發(fā)作的原因。
　　p-tau(Ser262)參與了戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠顳葉癲癇的形成。
　　p-tau(Ser262)可能參與戊四氮點(diǎn)燃模型中海馬苔蘚纖維出芽的形成。
　　第二部分蛋白磷酸酯酶2A對(duì)

6、戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠癇性發(fā)作的作用
　　目的:探討調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)對(duì)戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠癇性發(fā)作的作用。
　　方法:隨機(jī)選取200只6-8周SD雄性大鼠，分為對(duì)照組、戊四氮組、空白對(duì)照組和硒酸鈉組;對(duì)照組和戊四氮組造模同第一部分，硒酸鈉組大鼠先給予硒酸鈉配制飲用水進(jìn)飲1周，空白對(duì)照組則給予等量正常飲用水，1周后硒酸鈉組停止飲用藥物配制用水，隨之兩組均給予戊四氮（30mg/kg）腹腔注射，于注射后

7、第8天，硒酸鈉組大鼠再次給予硒酸鈉飲用水，連用4天，同時(shí)進(jìn)行戊四氮注射，每次注射后觀察大鼠癇性發(fā)作情況并記錄;采用免疫組織化學(xué)法、Westernblot及熒光定量PCR法首先檢測(cè)戊四氮組大鼠海馬組織中的PP2A、Methyl-PP2A和p-PP2A的表達(dá)變化;再檢測(cè)硒酸鈉組及空白對(duì)照組大鼠海馬p-PP2A和Methyl-PP2A的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.硒酸鈉組大鼠的癇性發(fā)作嚴(yán)重程度明顯下降，點(diǎn)燃率為25％，空白對(duì)照

8、組點(diǎn)燃率為94％。
　　2.戊四氮組p-PP2A的免疫組化及Western blot結(jié)果均顯示除3天時(shí)間點(diǎn)外，在余時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01)，表現(xiàn)為1周時(shí)間點(diǎn)開始表達(dá)升高，隨給藥次數(shù)的增多表達(dá)逐漸升高，4周時(shí)達(dá)到高峰，6周時(shí)表達(dá)下降至約相當(dāng)于1周時(shí)水平，Methyl-PP2A的Western blot結(jié)果顯示1周時(shí)間點(diǎn)表達(dá)開始下降，隨給藥次數(shù)的增多表達(dá)逐漸下降，4周時(shí)降至最低，

9、6周時(shí)維持于該水平，而總PP2A蛋白在戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬的表達(dá)與正常對(duì)照組比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.硒酸鈉激動(dòng)組p-PP2A的表達(dá)水平于1周、2周及4周均較同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組顯著下降(p＜0.05)，證明硒酸鈉可顯著增加PP2A的活性。與之相應(yīng)，硒酸鈉激動(dòng)組Methyl-PP2A的表達(dá)量在1周、2周及4周較同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組顯著升高(p＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了硒酸鈉增加了戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬的PP2A

10、活性。
　　結(jié)論:
　　PP2A的活性下調(diào)參與了戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制。
　　硒酸鈉抑制戊四氮模型大鼠癇性發(fā)作的級(jí)別，表明PP2A的活性改變與戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠癇性發(fā)作的嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　第三部分蛋白磷酸酯酶2A對(duì)戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬苔蘚纖維出芽的作用
　　目的:探討蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)對(duì)戊四氮點(diǎn)燃模型大鼠海馬p-tau(Ser262)和苔蘚纖維出芽的影響。
　　方法:72只

11、6-8周齡健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和硒酸鈉組，分別再隨機(jī)分為1周、2周和4周三個(gè)亞組，造模同第二部分。利用免疫組化和Western blot檢測(cè)p-tau(Ser262)在硒酸鈉組大鼠海馬組織中的表達(dá)變化，Timm染色檢測(cè)硒酸鈉組大鼠海馬苔蘚纖維出芽的動(dòng)態(tài)變化;
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化及Western blot均顯示硒酸鈉組大鼠海馬p-tau(Ser262)表達(dá)水平于各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均較同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組顯著下