鋅離子對(duì)蛋白磷酸酯酶2A的調(diào)節(jié)及其在阿爾茨海默病中的作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)是最常見(jiàn)的老年性癡呆癥,其主要病理學(xué)改變是腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)和老年斑(SP)的形成。NFTs的主要成分是過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau,異常磷酸化的tau喪失其促微管組裝和穩(wěn)定微管的功能,并聚集成為成對(duì)螺旋絲(PHF),最終導(dǎo)致NFT的形成、突觸的退變和神經(jīng)元的丟失,在AD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。而tau的磷酸化主要受相關(guān)蛋白激酶(proteinkinases,PK

2、)和蛋白磷酸酯酶(proteinphosphatases,PP)的調(diào)節(jié)。大量的研究事實(shí)表明,蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的活性在阿爾茨海默病人腦中下降并參與AD樣tau蛋白異常磷酸化的形成,但導(dǎo)致PP2A活性下降的上游因素和機(jī)制尚未闡明。
　　鋅(Zn)離子,是腦內(nèi)含量較為豐富的微量元素之一,參與神經(jīng)傳導(dǎo),抗氧化反應(yīng),并調(diào)節(jié)多種酶和生長(zhǎng)因子的活性。大量研究結(jié)果表明,胞外鋅離子水平增高可導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾。前期研究結(jié)

3、果顯示PP2A催化亞單位酪氨酸307位點(diǎn)(Y307)磷酸化后可明顯抑制PP2A活性,而在AD易感腦區(qū)鋅離子水平增高,提示鋅離子可能參與了AD腦內(nèi)PP2A活性的下調(diào)而促進(jìn)tau蛋白過(guò)度磷酸化。且到目前為止Zn對(duì)PP2A的調(diào)節(jié)及機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。
　　我們?cè)诒狙芯恐兄攸c(diǎn)探討了鋅離子對(duì)PP2A的調(diào)節(jié)及其在tau過(guò)度磷酸化中的作用,并且從分子水平解釋了Zn對(duì)PP2A的直接和間接抑制作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　第一部分鋅離子通過(guò)激活Sr

4、c途徑抑制PP2A活性和導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化
　　蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的活性在阿爾茨海默病(AD)人腦中下降并參與AD樣tau蛋白異常磷酸化的形成,但導(dǎo)致PP2A活性下降的上游因素和機(jī)制尚未闡明。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示,PP2A催化亞基的酪氨酸307位點(diǎn)(Y307)磷酸化修飾是導(dǎo)致PP2A失活的直接原因,但何種機(jī)制促使PP2A發(fā)生失活性修飾還不清楚。大量研究結(jié)果表明,胞外鋅離子水平增高可導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾,而在

5、AD易感腦區(qū)鋅離子水平增高,提示鋅離子可能參與了AD腦內(nèi)PP2A活性的下調(diào)而促進(jìn)tau蛋白過(guò)度磷酸化。
　　【目的】闡明鋅離子是否通過(guò)調(diào)節(jié)PP2A活性促進(jìn)tau蛋白異常過(guò)度磷酸化及調(diào)節(jié)PP2A活性的機(jī)制。
　　【材料和方法】實(shí)驗(yàn)在整體和細(xì)胞水平進(jìn)行。整體水平采用雄性SD大鼠,側(cè)腦室定位注射硫酸鋅,分組如下:生理鹽水對(duì)照組、30mM硫酸鋅給藥組,30mM硫酸鋅給藥+鋅離子特異性螯合劑CQ腹腔注射組。在側(cè)腦室注射6天后,麻醉取腦

6、分離海馬組織勻漿,用免疫印跡檢測(cè)tau磷酸化水平的變化,以及PP2AcY307磷酸化水平的變化,檢測(cè)PP2A的活性;細(xì)胞水平采用小鼠成神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞系,用100μM硫酸鋅處理3小時(shí)后提取蛋白,同樣方法檢測(cè)PP2AcY307磷酸化及tau磷酸化水平。同時(shí)在細(xì)胞水平給予PP2或DES預(yù)孵育30min或轉(zhuǎn)染野生型PP2A和突變性PP2A,在用用100μM硫酸鋅處理3小時(shí)后提取蛋白,同樣方法檢測(cè)PP2Ac磷酸化及tau磷酸化水平。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

7、水平,我們采用轉(zhuǎn)人tau的轉(zhuǎn)基因小鼠,鋅離子螯合劑CQ灌胃35天,檢測(cè)PP2Ac磷酸化及tau磷酸化水平及可溶性tau和不溶性tau的變化情況。
　　【結(jié)果】將鋅離子直接注射入整體動(dòng)物側(cè)腦室,6天后海馬PP2AcY307磷酸化水平明顯增高,伴隨PP2A活性下降,tau蛋白在多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)如Ser214、Thr205、Ser396、Ser404發(fā)生過(guò)度磷酸化;給動(dòng)物同時(shí)腹腔注射鋅離子螯合劑CQ,則可部分逆轉(zhuǎn)PP2AcY307

8、磷酸化水平和PP2A活性的抑制。用硫酸鋅處理小鼠成神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞,同樣導(dǎo)致PP2Ac發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾和活性下降,tau蛋白在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生過(guò)度磷酸化,伴隨Src失活性磷酸化位點(diǎn)酪氨酸529(Tyr529)磷酸化水平降低,Src激活。給予鋅同時(shí)給予PP2A的激動(dòng)劑或過(guò)表達(dá)野生型PP2A可逆轉(zhuǎn)鋅導(dǎo)致的PP2Ac活性下降以及tau蛋白的過(guò)度磷酸化。給予Src家族的特異性抑制劑PP2同樣可部分逆轉(zhuǎn)PP2AcY307磷酸化和PP2A活性的抑制

9、以及tau蛋白的磷酸化。轉(zhuǎn)基因小鼠的給予鋅離子螯合劑CQ灌胃后,Src活性抑制,PP2AcY307磷酸化水平降低,PP2A活性抑制和tau蛋白磷酸化被逆轉(zhuǎn),伴隨海馬內(nèi)不可溶性tau水平明顯下降,
　　【結(jié)論】鋅離子可通過(guò)激活Src而對(duì)PP2A進(jìn)行酪氨酸磷酸化修飾下調(diào)PP2A活性,從而導(dǎo)致tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化,促進(jìn)AD樣病變的形成。干預(yù)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鋅離子水平可上調(diào)PP2A活性并降低tau蛋白的磷酸化水平。因此干預(yù)鋅離子水

10、平有可能成為在體上調(diào)PP2A活性的新策略。
　　第二部分鋅離子體外直接抑制PP2A活性及機(jī)制研究
　　我們已經(jīng)在第一部分闡明鋅離子在整體動(dòng)物腦和細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)激活Src而使PP2AY307磷酸化失活和tau蛋白過(guò)度磷酸化。那么在體外鋅離子對(duì)PP2A是否有直接調(diào)節(jié)作用?其內(nèi)在機(jī)制是什么到目前為止尚無(wú)報(bào)道。
　　【目的】闡明鋅離子直接調(diào)節(jié)PP2A活性及其內(nèi)在機(jī)制。
　　【材料和方法】收集培養(yǎng)的N2a細(xì)胞并裂解,在不加入

11、ATP的情況下直接將細(xì)胞裂解液和100μM硫酸鋅或10nM岡田酸(OA)孵育0,5,15,30min,用免疫印跡檢測(cè)tau磷酸化水平的變化。同樣的方法用不同濃度(0,10,50,100μM)硫酸鋅與細(xì)胞裂解液共孵育不同時(shí)間(0,5,15,30,60min),檢測(cè)PP2A活性。構(gòu)建不同片段的PP2Ac原核表達(dá)質(zhì)粒并純化,將純化的GST-PP2AR1-50R、PP2AR51-270R和PP2AR271-309R分別和100μM硫酸鋅孵育,檢

12、測(cè)PP2A活性。最后我們用親和層析柱(IDA)預(yù)先孵育硫酸鋅或不孵育硫酸鋅,分別讓純化的GST-PP2AR1-50R、GST-PP2AR51-270R和GST-PP2AR271-309R自然流過(guò)IDA柱,然后用EDTA洗脫,收集不同組分的液體用免疫印跡檢測(cè)GST的變化以確定不同片段PP2Ac與Zn的結(jié)合情況。
　　【結(jié)果】將硫酸鋅和細(xì)胞裂解液共孵育可延緩tau蛋白發(fā)生去磷酸化的進(jìn)程,共孵育15min時(shí)已和強(qiáng)PP2A抑制劑岡田酸具有

13、同等的抑制tau蛋白去磷酸化的效果,同時(shí)隨著時(shí)間和硫酸鋅濃度的變化,PP2A的活性被抑制,在10μM,30min時(shí)到達(dá)最低水平,抑制率下降30％。而且給予硫酸鋅10μM時(shí),PP2A的抑制效應(yīng)有時(shí)間依賴性。說(shuō)明在體外鋅離子直接抑制PP2A活性。為了進(jìn)一步確定鋅離子對(duì)PP2A的直接抑制作用,將截?cái)嗟腜P2A與鋅離子直接孵育發(fā)現(xiàn)鋅離子可以直接抑制GST-PP2AR51-270R片段的活性。通過(guò)IDA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鋅離子僅和GST-PP2AR51-