低濃度異氟醚對(duì)新生SD幼鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響.pdf

1、研究目的：追蹤觀察低濃度異氟醚暴露下新生SD幼鼠神經(jīng)元凋亡，海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、存活、分化遷移及定位等的變化，從而探討低濃度異氟醚暴露對(duì)腦發(fā)育高峰期海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響。研究低濃度異氟醚暴露對(duì)海馬腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，初步探討異氟醚影響海馬神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.異氟醚暴露方法 采用在麻醉機(jī)回路中放置適當(dāng)大小的麻醉箱，調(diào)節(jié)箱內(nèi)異氟醚濃度的方法建立幼鼠吸入麻醉模型。將120只出生5天的

2、SD幼鼠按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組(Con組，n=60)和實(shí)驗(yàn)組(Iso組，n=60)。異氟醚的暴露方式為：實(shí)驗(yàn)組(lso組)幼鼠分別在出生后第5、6、7三日(PND5，6，7)，每日吸入氮氧混合空氣與0.5％異氟醚的混合氣1次，每次持續(xù)3h，而對(duì)照組(Con組)幼鼠在相同時(shí)間內(nèi)只吸入空氣。 2.具體研究?jī)?nèi)容為：①用免疫組化法檢測(cè)激活型—caspase3的表達(dá)觀察異氟醚暴露完畢后24h幼鼠神經(jīng)元凋亡的變化；②用腹腔注射5-溴—2-

3、脫氧尿苷(BrdU)結(jié)合免疫組化標(biāo)記增殖神經(jīng)元的方法研究異氟醚暴露完畢后不同時(shí)間點(diǎn)(Oday，3day，7day，10day，14day)齒狀回神經(jīng)元增殖數(shù)目的變化；③用腹腔注射5-溴—2-脫氧尿苷(BrdU)結(jié)合免疫組化方法在異氟醚暴露完畢后海馬齒狀回神經(jīng)增殖高峰期(Oday，3day)行BrdU標(biāo)記，觀察BrdU標(biāo)記2周后幼鼠齒狀冋新生細(xì)胞的存活、分化遷移及定位的演變情況；④用Western blot免疫印記法檢測(cè)異氟醚暴露完畢后不

4、同時(shí)間點(diǎn)(0day，3day，7day)海馬腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)組幼鼠各時(shí)間點(diǎn)均配有相同數(shù)量的同窩幼鼠做對(duì)照研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: ①異氟醚暴露完畢后24h，海馬CA1、CA3、DG區(qū)，大腦皮質(zhì)及丘腦等腦區(qū)組織結(jié)構(gòu)完整清晰，可見(jiàn)少量Caspase—3陽(yáng)性細(xì)胞，與對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 ②BrdU標(biāo)記后24h，海馬齒狀回的BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞層

5、下區(qū)。異氟醚暴露完畢后0day，3day，7day三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均較相應(yīng)對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Oday組約增加25.4％(Con1375±390 vs Iso1724±334，P=0.028)，3day組達(dá)到峰值，約增加45.3％(Con727±358 vs Iso1056±392，P=0.001)，7day組逐漸減少，約增加14.6％(Con403±116 vs Iso462±132

6、，P=0.012)。而在10day，14day兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)對(duì)照組BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 ③BrdU標(biāo)記2周后，Oday組和3day組實(shí)驗(yàn)組幼鼠齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目仍高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)。但兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞2周后的存活率均無(wú)差別(P>0.05)。2周內(nèi)大部分存活的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞已遷移植入顆粒細(xì)胞層的中下部，顆粒細(xì)胞全層均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞

7、，其形態(tài)、分布位置等在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間均未見(jiàn)明顯差別。 ④異氟醚暴露完畢后0day、3day時(shí)實(shí)驗(yàn)組成熟型BDNF的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而7day時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組成熟型BDNF的表達(dá)量未見(jiàn)差異(P>0.05)。 結(jié)論: ①低濃度異氟醚(0.5％)反復(fù)暴露不會(huì)增加新生SD幼鼠腦神經(jīng)元的凋亡，但可促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，并且新生成的神經(jīng)元可正常存活、遷移、分化并植入顆粒細(xì)胞層。