rAAV介導(dǎo)調(diào)控VEGF基因表達(dá)對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.分別構(gòu)建、制備攜帶外源性hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因短發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)雙鏈RNA(ShortHairpinRNA，shRNA)片段的2型重組腺相關(guān)病毒載體(RecombinantAdeno-associatedViralVector，rAAV)，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)工具。 2.觀察缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的時(shí)空規(guī)律，以及齒狀回新生細(xì)胞的遷移和功能特點(diǎn)。 3.探討缺血性腦損傷

2、后海馬內(nèi)源性VEGF表達(dá)的時(shí)間和空間分布特點(diǎn). 4.探討在海馬導(dǎo)入外源性hVEGF165基因?qū)θ毖阅X損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分：攜帶hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和制備 1.通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶hVEGF165基因的2型rAAV(rAAV2)包裝質(zhì)粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP，并進(jìn)行酶切鑒定；

3、 2.根據(jù)鼠源VEGF基因(NM031836)CDS區(qū)編碼序列設(shè)計(jì)、選擇三段19nt的寡核苷酸序列作為靶向內(nèi)源性VEGF基因的shRNA片段序列，并以此合成三對(duì)長(zhǎng)引物單鏈DNA片段，經(jīng)退火、雙酶切后與同樣雙酶切的質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6連接、轉(zhuǎn)化，獲得三個(gè)質(zhì)粒； 3.將獲得的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，以RealTimePCR和Westernblot方法篩選 4.通過一種輔助病毒感染一個(gè)載體細(xì)胞株的策略，分別制備

4、rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)病毒載體。 第二部分：腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分化及新生細(xì)胞功能的研究 1.采用不同劑量BrdU經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法確定BrdlJ標(biāo)記大鼠海馬齒狀回新生細(xì)胞的最佳BrdU給藥劑量； 2.利用4-VO(FourVesselOcclusion)法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，于缺

5、血性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹腔注射BrdU. 3.利用免疫組織化學(xué)和雙標(biāo)記、三標(biāo)記免疫組織熒光化學(xué)方法觀察缺血性腦損傷后齒狀回新生細(xì)胞遷移、分化及功能特點(diǎn)。 第三部分：內(nèi)源性VEGF基因在腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生中的作用及機(jī)制研究 1.首先采用RealTimePCR方法和免疫組織化學(xué)、免疫組織熒光化學(xué)方法對(duì)缺血性腦損傷后海馬內(nèi)源性VEGFmRNA、齒狀回VEGF蛋白表達(dá)的時(shí)空特點(diǎn)以及齒狀回微血管密度(Micr

6、ovesselDensity，MVD)的變化進(jìn)行觀察； 2.將rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，觀察其對(duì)缺血性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)海馬內(nèi)源性VEGFmRNA水平、齒狀回VEGF蛋白表達(dá)、齒狀回微血管密度、齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖水平及齒狀回新生細(xì)胞遷移的影響。 第四部分：重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)外源性VEGF基因表達(dá)對(duì)腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 1.將

7、攜帶hVEGF165基因的rAAV2載體立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，2w后建立大鼠腦缺血模型，采用RealTimePCR方法觀察其對(duì)缺血性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)海馬hVEGF165mRNA水平的影響； 2.采用免疫組織化學(xué)和免疫組織熒光化學(xué)方法觀察比較海馬齒狀回外源性hVEGFl65基因長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)缺血性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)齒狀回VEGF蛋白表達(dá)、齒狀回MVD及齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一部

8、分：攜帶hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和制備 1.鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的病毒包裝質(zhì)粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP構(gòu)建正確。 2.鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的3個(gè)攜帶靶向鼠內(nèi)源性VEGF基因shRNA片段的質(zhì)粒構(gòu)建正確，均攜帶有啟動(dòng)EGFP轉(zhuǎn)錄的CMV啟動(dòng)子和啟動(dòng)shRNA序列轉(zhuǎn)錄的U6啟動(dòng)子。 3.制備的兩株病毒載體rAAV2-hVEGF165-IRE

9、S-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)經(jīng)鑒定和質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示構(gòu)建、包裝準(zhǔn)確，純度好，感染細(xì)胞效率高。 第二部分：腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分化及新生細(xì)胞功能的研究 1.BrdU腹腔給藥劑量為10mg/kg組大鼠齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與50mg/kg、100mg/kg劑量組均有顯著性差異 2.大鼠腦缺血后3d時(shí)，齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增多(P<0.05)，并

10、于缺血后第6d時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)，缺血后第48d時(shí)恢復(fù)至正常水平(P>0.05)。 3.缺血性腦損傷大鼠齒狀回新生細(xì)胞(BrdU陽(yáng)性細(xì)胞)存活4w后大多呈單個(gè)散在分布狀態(tài). 第三部分：內(nèi)源性VEGF基因在腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生中的作用及機(jī)制研究 1.缺血性腦損傷后海馬VEGFmRNA表達(dá)水平反應(yīng)性升高，缺血后24hr達(dá)到峰值，與正常對(duì)照組和其它各時(shí)間點(diǎn)大鼠相比差異均有顯著性意義(P<0.05)；其

11、后海馬VEGFmRNA水平開始逐漸下降，于缺血后第12d回落至正常水平(P>0.05)。 2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示缺血性腦損傷后可見VEGF蛋白少量表達(dá)，24hr海馬VEGF蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，12d時(shí)僅有弱表達(dá)；缺血性腦損傷后VEGF蛋白在海馬區(qū)的表達(dá)主要集中于海馬齒狀回。 3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠海馬區(qū)僅有CD34抗原(MVD指標(biāo))呈條索狀弱陽(yáng)性表達(dá) 4.rAAV2-EGFP-U6-shRN

12、A(VEGF)立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，2w后制作缺血性腦損傷動(dòng)物模型。 5.RealTimePCR分析結(jié)果 6.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 7.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 第四部分：重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)外源性VEGF基因表達(dá)對(duì)腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 1.RealTimePCR檢測(cè)結(jié)果；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。 2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 3.導(dǎo)入外源性hVEGF1

13、65基因大鼠缺血性腦損傷后6d和24hr時(shí)，其右側(cè)海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)缺血性腦損傷大鼠(P<0.05)。 結(jié)論： 1.本課題中制備的兩株病毒載體rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)，構(gòu)建、包裝準(zhǔn)確，純度好，感染細(xì)胞效率高。 2.采用立體定向技術(shù)將制備的兩株病毒載體微量注射給藥至海馬齒狀回后可以在該區(qū)域高效、穩(wěn)定和持續(xù)的表達(dá)外

14、源性hVEGF165或剔降內(nèi)源性VEGF基因表達(dá)。 3.2型rAAV是一種合適的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因?qū)胼d體，利用病毒載體實(shí)現(xiàn)RNAi是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行功能基因鑒定的有效研究手段。 4.50mg/kg以上劑量的BrdU腹腔注射給藥可較為理想的標(biāo)記海馬齒狀回新生細(xì)胞。 5.缺血性腦損傷可誘導(dǎo)海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖水平在一定時(shí)間窗(3d～24d)內(nèi)上調(diào)。 6.缺血性腦損傷后海馬齒狀回新生細(xì)胞可遷移入顆粒細(xì)胞

15、層，并具備原有功能性顆粒細(xì)胞同樣的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，合成并表達(dá)神經(jīng)活性遞質(zhì)。 7.缺血性腦損傷后遷移入顆粒細(xì)胞層的海馬齒狀回新生細(xì)胞可與其周圍的顆粒細(xì)胞一樣，在病理性刺激下同時(shí)被迅速激活。 8.缺血性腦損傷后，海馬內(nèi)源性VEGF基因表達(dá)水平反應(yīng)性上調(diào)促進(jìn)缺血誘導(dǎo)的齒狀回神經(jīng)發(fā)生和齒狀回新生血管形成。 9.不同細(xì)胞來源的VEGF在缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮了不同的作用。 10.缺血性腦損傷后與內(nèi)源

16、性VEGF基因表達(dá)水平變化相關(guān)的新生血管形成主要參與了缺血性腦損傷后齒狀回新生細(xì)胞的分化和遷移過程，并在其中發(fā)揮對(duì)新生細(xì)胞的支持、營(yíng)養(yǎng)和遷移導(dǎo)向作用。 11.缺血性腦損傷后，不同細(xì)胞來源的。 12.海馬齒狀回導(dǎo)入外源性hVEGF165基因可促進(jìn)缺血性腦損傷誘導(dǎo)的齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平上調(diào)。 本課題的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1.從分子和基因水平全面、系統(tǒng)的探討了海馬內(nèi)源性VEGF基因表達(dá)在缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生

17、中的作用及相關(guān)機(jī)制； 2.從基因治療的角度探討了導(dǎo)入外源性VEGF基因?qū)θ毖阅X損傷后涉及海馬結(jié)構(gòu)和功能重塑相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)事件的影響及治療意義，為以VEGF基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行缺血性腦血管病基因治療研究和VEGF基因治療產(chǎn)品最終進(jìn)入缺血性腦血管病臨床治療提供了不可或缺的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)； 3.為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)利用病毒基因載體通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)封閉內(nèi)源性基因表達(dá)和介導(dǎo)外源性基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)手段進(jìn)行功