卷曲螺旋Hpa1Xoo-N21多肽在煙草中的受體分析.pdf

1、Harpin蛋白啟動(dòng)的過(guò)敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和抗病信號(hào)通路的類別與其在植物上起始作用部位或作用靶標(biāo)密切相關(guān)，因此篩選、分離和鑒定受體分子將有助于我們更全面理解harpin蛋白結(jié)構(gòu)及其與植物的互作機(jī)制。本文根據(jù)水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）Hpa1Xoo蛋白N端N21多肽能形成卷曲螺旋（coiled-coil, CC）的特征，采用親和層析（

2、affinity chromatography，AC）方法從煙草中篩選與其結(jié)構(gòu)互作的受體分子，并對(duì)受體分子進(jìn)行鑒定和理化、結(jié)構(gòu)特征分析。
　　將化學(xué)合成的Hpa1Xoo-N21多肽偶聯(lián)到溴化氰活化的高流速4B瓊脂糖微球(CNBrBio-sep4FF)載體上，填充制備AC柱，分別用從煙草（Nicotiana tabacum L.“Xanthi”）葉片提取的質(zhì)外體蛋白、細(xì)胞壁蛋白和細(xì)胞質(zhì)膜蛋白濃縮液上樣，平衡后用非特異性洗脫液（0.1

3、 mol/L NaCl,0.2 mol/LNaHCO3，pH9.0）洗脫，僅從質(zhì)外體蛋白樣液獲得一條單一的分子量約20 kDa的SDS-PAGE條帶。經(jīng)膠內(nèi)酶解、MALDI-TOF/MS-MS檢測(cè)和Mascot搜索串級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)放氧復(fù)合物PsbP蛋白（也稱23 kDa蛋白）。用Biogem平臺(tái)的在線程序S2Spred(http://www.bio gem.org/tool/S2Spred/)對(duì)鑒定獲得的受體蛋白氨基

4、酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其多個(gè)區(qū)域能形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，用COILS（http://www.ch.embnet.org/so ftware/COILS_form.html）在線程式進(jìn)一步預(yù)測(cè)CC形成的可能性，結(jié)果顯示35-55位（AR1表示）、97-117位（AR2表示）和156-176位（AR3表示）氨基酸殘基域具有形成CC的可能性，其中35-55位的可能性較高，根據(jù)CC互作的原理，推測(cè)該蛋白的這段區(qū)域可能以CC方式與N21多肽進(jìn)行

5、互作。
　　圓二色(CD)光譜分析表明化學(xué)合成的受體多肽AR1、AR2、AR3都含有α-螺旋，含量AR1＞AR2＞AR3，分析結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。聚合狀態(tài)預(yù)測(cè)(LOGICOIL和SCORER2.0程式)表明這些多肽受體自身分子間及與N21多肽都能通過(guò)CC結(jié)構(gòu)形成二聚體或三聚體。CD譜數(shù)據(jù)擬合表明，AR1與N21的等摩爾混合液(AR1+N21)的α-螺旋含量最高，達(dá)31.2％，其次是AR2+N21和AR3+N21，α-螺

6、旋含量分別為26.6％和25.7％。變溫圓二色光譜發(fā)現(xiàn)AR1+N21多肽混合液存在兩相結(jié)構(gòu)過(guò)程，TM為56±2℃。而AR2+N21和AR3+N21多肽混合水溶液變溫曲線近似直線，缺乏兩相過(guò)程，僅AR2+N21存在微弱的去折疊過(guò)程。因此變溫CD證明了受體分子可與N21多肽互作形成聚體結(jié)構(gòu)，也說(shuō)明篩選的受體具有較高的可信度。用FAM熒光基團(tuán)對(duì)N21多肽的5'-N端進(jìn)行標(biāo)記，注射煙草葉片8h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的N21多肽大部分位