IL-9+CD4+T細胞-IL-9與幽門螺桿菌感染的相關性研究和γδT細胞在金黃色葡萄球菌肺炎的宿主應答中的作用.pdf

1、第一部分，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是彎曲、棒狀的革蘭陰性桿菌,主要定植在胃部和十二指腸部位(1)。近年來的大量研究證明,幽門螺桿菌可引發(fā)人群中不同程度的急性或慢性胃炎,少數(shù)發(fā)展為消化性潰瘍和胃癌(2)。其中按是否含有細胞毒素相關蛋白(cytotoxinassociatedprotein,CagA)將幽門螺桿菌分為Ⅰ型和Ⅱ型。在臨床大多數(shù)胃炎病例中,胃體萎縮性胃炎是由Ⅰ型H.pylori感染引起

2、的主要臨床胃炎類型,并與胃癌的發(fā)生高度相關。CagA依賴于Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretionsystem,T4SS),轉運至胃粘膜上皮細胞并發(fā)生磷酸化,從而激活下游細胞信號通路,發(fā)揮細胞免疫學功能,引起胃上皮細胞“蜂巢”型形態(tài)學改變和更嚴重的感染癥狀(3,4)。受到刺激的上皮細胞釋放大量炎癥趨化因子和細胞因子等誘導宿主產(chǎn)生相應的細胞免疫應答。已有文獻報道,H.pylori作為胞外菌可誘導宿主產(chǎn)生以CD4+T細胞為主的免疫應答反應

3、,CD4+T細胞應答在H.pylori感染的機體免疫炎性損傷和抗感染免疫保護中發(fā)揮重要作用(5)。細胞因子IL-9是Uyttenhove等(6)人于1988年在Th2細胞株中發(fā)現(xiàn)的T細胞生長因子,它具有多效性的免疫功能。2011年Stephens等人在自身免疫性胃炎疾病中發(fā)現(xiàn)Th17分泌的IL9通過刺激粘膜肥大細胞增殖間接抑制Th17的免疫活性,起到一定的抗炎的作用,且提出IL-9最終發(fā)揮促炎還是抗炎功能的重要因素是由疾病造成的微環(huán)境所

4、決定(7)。近年來,已有多篇文獻報導IL-9功能具有雙重性,一方面IL-9激活巨噬細胞,肥大細胞和嗜酸細胞起到促進炎癥和過敏反應;另一方面IL-9負向調節(jié)病毒介導的炎癥和增強天然Treg細胞免疫抑制活性。在哮喘小鼠模型中,Arnold等通過誘導iTreg細胞揭示幽門螺旋桿菌感染能夠降低哮喘嚴重程度,提示幽門螺旋桿菌感染可能與哮喘程度存在負相關(8)。綜上,CD4+T細胞參與宿主的免疫應答反應,其中細胞因子IL-9是否也參與機體免疫應答以

5、及發(fā)揮怎樣的免疫調節(jié)功能尚不清楚。
　　本課題將以IL-9+CD4+T細胞為主要研究對象,在H.pylori/B0菌株感染野生型(widetype,WT)BALB/c小鼠和IL-9基因敲除(IL-9ko)小鼠的模型下,初步研究IL-9+CD4+T細胞/IL-9與幽門螺桿菌感染的相關性研究,將為深入探討IL-9+CD4+T細胞在H.pylori自然感染條件下發(fā)揮復雜的免疫學功能提供新的參考和指導。
　　方法：
　　1.H

6、.pylori菌株感染受檢者血標本中細胞因子檢測
　　收集了臨床受檢者的血清,通過檢測血清中抗H.pylori特異性抗體把標本分為H.pylori感染陽性和陰性2組,通過ELISA方法檢測人外周血清中IL-9蛋白水平的表達。
　　2.IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中的表達檢測
　　(1)H.pylori/B0菌株感染BALB/c、IL-9ko小鼠模型建立方法(2)IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中動態(tài)表達檢測

7、　　3.IL-9在幽門螺桿菌感染小鼠模型中功能的初步研究(1)H.pylori/B0在小鼠胃內(nèi)定植量水平檢測
　　(2)胃組織炎癥評分及病理HE染色結果分析4.IL-9在幽門螺桿菌感染中的細胞來源研究
　　(1)幽門螺桿菌患者外周血產(chǎn)IL-9的T細胞的誘導分化研究
　　(2)幽門螺桿菌感染小鼠脾臟產(chǎn)IL-9的T細胞的誘導分化研究
　　結果：
　　1.臨床血清標本中細胞因子IL-9在H.pylori感染陰性受

8、檢者中表達明顯高于H.pylori感染陽性受檢者。
　　2.相對于H.pylori/B0未感染組,野生型小鼠背景的H.pylori感染組的胃部H.pylori/B0定植在在感染后各個時間點明顯增高。結果證明H.pylori感染小鼠的動態(tài)評價模型建立成功。28天時,H.pylori/B0菌株感染BALB/c與未感染對照組相比,細胞因子IL-17、IFN-γ和IL-10的mRNA水平都有顯著提高,相比之下IL-10和IFN-γ增加更明

9、顯。而感染組IL-9的mRNA水平較未感染組顯著下降。
　　3.BALB/c小鼠在H.pylori/B0菌株感染后的第28天胃內(nèi)定植量達到最高值,其前后一周內(nèi)維持在較高水平,但35d后定植量開始逐漸下降。IL-9ko感染組小鼠胃組織內(nèi)定植量水平高于BALB/c小鼠感染組,在感染后第28天檢測胃內(nèi)定植量也達到峰值。IL-9ko小鼠在敲除細胞因子IL-9后,H.pylori/B0菌株感染小鼠胃粘膜組織的定植量比WT感染組小鼠高。在相同

10、實驗條件下,觀察HE染色病理切片,IL-9ko感染組胃固有層部位炎癥細胞侵潤比WT感染組更多且胃粘膜表面局部有少量壁細胞破損。
　　4.H.pylori菌株感染陰性受檢者和陽性受檢者PBMC中的IL-9+CD4+T細胞占CD4T淋巴細胞的比例分別為1.9％和0.914%,統(tǒng)計結果也顯示陰性受檢者組IL-9+CD4+T細胞比陽性受檢者組多。在小鼠體內(nèi)再次驗證以上結果,H.pylori.B0菌株感染陰性小鼠和陽性小鼠脾單個核細胞中的I

11、L-9+CD4+T細胞占CD4T淋巴細胞的比例分別為0.7%和0.31%,統(tǒng)計結果也顯示陰性受檢者組IL-9+CD4+T細胞比陽性受檢者組多。且加入適當細胞因子可誘導IL-9+CD4+T細胞的分泌IL-9。
　　結論：
　　1.H.pylori感染人和動物體后,細胞因子IL-9在轉錄水平和細胞水平都下降。在WT和IL-9ko小鼠感染模型中,驗證IL-9與H.pylori/B0引起的免疫應答反應相關。
　　2.在H.py

12、lori感染后引起的宿主免疫應答反應中,T細胞經(jīng)體外誘導分化后,IL-9可以來自于細胞因子誘導分化下的Th9細胞。
　　第二部分，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,S.aureus)是一種有鞭毛、無芽胞、多數(shù)無莢膜的革蘭陽性胞外細菌,顯微鏡下形態(tài)為圓球型,直徑約0.8μm,葡萄串狀(1)。金黃色葡萄球菌是人類重要的致病菌,可引發(fā)從皮膚和軟組織感染到侵襲性感染疾病,包括肺炎、骨髓炎、膿毒性關節(jié)炎、菌血癥、心內(nèi)

13、膜炎和蜂窩織炎等。由金黃色葡萄球菌引起的肺炎占醫(yī)源性肺炎和社區(qū)性肺炎的比例分別為20-50%和25.5%,導致嚴重的肺內(nèi)感染,具有高發(fā)病率及高死亡率(2,3)。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的多種毒素和侵襲性酶,包括:血漿凝固酶、葡萄球菌溶血素、殺白細胞素、腸毒素、表皮溶解毒素、毒性休克綜合毒素Ⅰ和葡激酶。近年來,金黃色葡萄球菌和甲氧西林易感金黃色葡萄球菌感染引起后天免疫性群體耐甲氧西林金黃色葡萄球(community-ac

14、quiredmethicillin-resistantS.aureus,CA-MRSA),它能抵抗人類目前所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,給臨床治療帶來很大困難,引起人們的高度重視。
　　在固有性免疫應答中,根據(jù)TCR雙肽鏈結構的不同,可將T細胞分為αβT細胞和γδT細胞兩類。其中γδT細胞在人和動物體內(nèi)表達量較少,主要分布在皮膚和呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)等黏膜組織部位。多數(shù)γδT細胞表面不表達MHCI和MHCII類分子自身識別的CD8

15、和CD4共受體分子。ΓδT細胞是固有免疫和獲得性免疫聯(lián)系的橋梁,具有免疫監(jiān)視、免疫調節(jié)、腫瘤細胞識別等功能。在細菌感染的宿主免疫應答反應中,γδT細胞發(fā)揮重要功能,是固有免疫的第一道防線。根據(jù)細胞因子分泌的不同可分為兩種的Vγ1+和Vγ4+細胞亞群。
　　金黃色葡萄球菌感染可引起宿主體內(nèi)的固有性免疫應答反應,入侵的病原微生物入可誘導宿主大量的中性粒細胞被募集到感染部位清除病原菌(4)。盡管肺部的γδT細胞只占據(jù)固有性免疫細胞中的一

16、小部分,但他們在病原微生物入侵中是抵御病原微生物的第一道防線。根據(jù)文獻報道,在肺炎克雷伯氏菌、結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌引起的肺部感染,去除γδT細胞可降低宿主免疫保護功能,導致更嚴重的肺組織炎癥損傷。而γδT細胞在金黃色葡萄球菌誘導的皮膚病中具有重要作用。近年來,γδT細胞在金黃色葡萄球菌感染的肺組織炎癥中的免疫應答作用和機制還未見報道。
　　為了研究γδT細胞在急性金黃色葡萄球菌肺炎中的作用,本課題建立金黃色葡萄球菌株感染的野生

17、型(WT)C57BL/6小鼠和TCR-δ?/?小鼠的肺炎模型,以γδT細胞為研究對象,初步探討了在金黃色葡萄球菌的肺炎中γδT細胞對宿主機體的免疫應答作用和機制研究。
　　方法：
　　1.S.aures/75菌株感染C57BL/6、B6TCR-δ?/?小鼠模型建立方法2.肺組織中指標檢測
　　2.1.細菌定植總數(shù)評價
　　2.2.肺組織病理切片的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色

18、　　2.3.Real-timePCR法檢測小鼠肺組織細胞因子的mRNA表達
　　2.4.流式細胞技術檢測細胞內(nèi)因子
　　結果：
　　1.在S.aures/75菌株感染小鼠肺炎中小鼠肺組織γδT細胞明顯增加,Vγ4+細胞亞型數(shù)量多于Vγ1+亞型。
　　2.TCR-δ?/?小鼠可導致宿主對細菌清除減弱和急性肺損傷的嚴重程度減弱。
　　3.感染S.aures/75菌株后,在TCR-δ?/?小鼠感染部位,表現(xiàn)出中性

19、粒細胞的募集被抑制及細胞因子產(chǎn)生減少的現(xiàn)象。
　　4.S.aures/75菌株感染可早期誘導WT小鼠在肺組織局部引起γδT細胞免疫應答反應,產(chǎn)細胞因子IL-17。但在TCR-δ?/?小鼠感染組中,γδT細胞的缺失導致IL-17的產(chǎn)生的缺失。
　　5.γδT細胞的缺失導致中性粒細胞募集受到抑制。
　　結論：
　　1.在S.aures/75菌株感染的肺組織中,γδT細胞的增加有助于宿主體內(nèi)細菌的清除和肺組織炎癥損傷。