高糖預(yù)處理對單核細(xì)胞應(yīng)答金黃色葡萄球菌刺激的影響.pdf

1、目的:
　　觀察高糖狀態(tài)下金黃色葡萄球菌(SA)誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞株THP-1在不同時間段的凋亡特點，以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和白細(xì)胞介素(IL)-1β蛋白表達(dá)和分泌規(guī)律。探討高糖預(yù)處理對單核細(xì)胞以及單核細(xì)胞應(yīng)答金黃色葡萄球菌刺激的影響。
　　方法:
　　以高糖預(yù)處理的THP-1單核細(xì)胞為研究對象，分別以熱滅活金黃色葡萄球菌(HKSA)和金黃色葡萄球菌(SA)活菌為刺激條件。
　　1.體外培養(yǎng)THP-1細(xì)

2、胞，采用2×2析因分析實驗設(shè)計，以高糖、細(xì)菌2個因素，每個因素2個水平交叉分為對照組、高糖組、細(xì)菌組和高糖細(xì)菌組。各組提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(SQ-RT-PCR)法，檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)。
　　2.THP-1單核細(xì)胞分別以5.5mmol/L葡萄糖（低糖，LG）和25.0mmol/L葡萄糖（高糖，HG）體外培養(yǎng)12h～8d。將HG和LG培養(yǎng)6d的單核細(xì)胞加入HKS

3、A（細(xì)胞、細(xì)菌比1∶10）。分別于HKSA加入前和加入后2～48h檢測細(xì)胞凋亡、IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)。細(xì)胞凋亡采用AnnexinⅤ與PI雙染法，流式細(xì)胞技術(shù)檢測;IL-1β蛋白分泌采用ELISA法檢測;提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Rt-PCR)法，檢測iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)情況。
　　3.分別以LG和HG體外培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞12h～7d。將HG

4、和LG培養(yǎng)6d的單核細(xì)胞加入SA（細(xì)胞、細(xì)菌比1∶5）。分別于SA加入前和加入后1～24h檢測細(xì)胞凋亡、iNOS和IL-1β表達(dá)。細(xì)胞凋亡采用AnnexinⅤ與PI雙染法，流式細(xì)胞技術(shù)檢測;iNOS蛋白表達(dá)采用Western blot技術(shù)檢測;IL-1β檢測采用ELISA法檢測;檢測iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)采用Rt-PCR法。
　　4.體外培養(yǎng)單核細(xì)胞株THP-1，分別以LG和HG培養(yǎng)7d。取單核細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約5×10

5、6/ml）和SA(2×107CFU/ml)，加調(diào)理素（混合的新鮮人血清），置37℃振蕩孵育。取懸浮細(xì)胞混合液，以平皿接種法計算殺菌率(％)。
　　結(jié)果:
　　1.高糖、細(xì)菌以及兩者交互效應(yīng)均影響THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β。高糖組與對照組比較細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β均減弱(P＜0.01);高糖細(xì)菌組表達(dá)iNOS和IL-1β均顯著低于細(xì)菌組(P＜0.01)。細(xì)菌組與對照組比較iNOS和IL-1β表達(dá)均增加;

6、高糖細(xì)菌組與細(xì)菌組比較IL-1β表達(dá)增加，iNOS表達(dá)變化不顯著。
　　2.高糖刺激THP-1單核細(xì)胞12～48h后IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)較刺激前顯著增加(P＜0.05)，iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)在24h達(dá)最高值，IL-1β蛋白分泌48h達(dá)高峰。細(xì)胞凋亡在高糖刺激48h～4d較刺激前顯著增加(P＜0.05)。兩組細(xì)胞加入HKSA后6～48h表達(dá)iNOS和L-1β顯著高于刺激前(P＜0.01)，24

7、h達(dá)高峰，48h表達(dá)下降;IL-1β蛋白分泌在48h達(dá)最高值。兩組細(xì)胞凋亡率在加入HKSA后12h、24h、48h逐漸增加(P＜0.01)。單核細(xì)胞加入HKSA前和加入HKSA后12h，高糖組與低糖組比較，高糖組IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)均低于低糖組，凋亡率高于低糖組(P＜0.05)。
　　3.THP-1單核細(xì)胞分別于低糖和高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后，iNOS和IL-1β表達(dá)均減少(P＜0.05)。
　　4.T

8、HP-1單核細(xì)胞分別于低糖和高糖環(huán)境培養(yǎng)6天后，兩組細(xì)胞分別加入SA（細(xì)胞、細(xì)菌比1∶5），iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)在1h顯著增加，6h達(dá)到最高水平，24h減低。兩組細(xì)胞凋亡率在加入SA后1h、6h、12h、24h逐漸增加（P＜0.01）;兩組細(xì)胞24h凋亡率分別為48.24±6.32％(LG)和61.37±7.14％(HG)(P＜0.05)。高糖組與低糖組比較，高糖組iNOS和IL-1β表達(dá)均低于低糖組，凋亡率高于低糖組(P＜

9、0.05)。
　　5.THP-1單核細(xì)胞分別于低糖和高糖環(huán)境培養(yǎng)24h后，高糖組吞噬功能顯著低于低糖組(P＜0.05)，吞噬率分別為93.21±8.75％和82.41±7.12％。與吞噬率一致，高糖組殺菌率顯著低于低糖組（P＜0.05），殺菌率分別為85.32±7.33％和70.32±5.95％。
　　結(jié)論:
　　高糖和(HK)SA對單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β的影響與刺激時間有關(guān);以SA刺激處于高糖狀態(tài)的單核細(xì)胞