肺腺癌細胞中半乳糖凝集素--3與肝再生磷酸酶--3對RhoA--GTP磷酸化信號途徑激活方式的研究.pdf

1、肺腺癌細胞G a l e c t i n 一3 與P R L 一3 對R h o A —G T P 磷酸化信號途徑激活方式的研究 !肺腺癌細胞中半乳糖凝集素一3 與肝再生磷酸酶一3 對R h o A - G T P 磷酸化信號途徑激活方式的研究中文摘要目的：應用基因分子生物學技術在肺腺癌細胞中探討G a l e c t i n 一3 與P h o s p h a t a s eo fR e g e n e r a t i n gL i

2、v e r 一3 ( P R L 一3 ) 在R h o A —G T P 磷酸化信號途徑激活過程中的相互作用，為進一步研究肺腺癌細胞侵襲、轉移能力增強的分子機制和肺腺癌分子治療方法提供新的思路和實驗依據(jù)。方法：1 、使用攜帶G a l e c t i n 一3 m R N A 外顯子基因片段的G V 2 0 8 慢病毒質粒轉染構建并篩選過表達G a l e c t i n - 3 的L T E P - a 2 肺腺癌細胞株。2 、用脂

3、質體轉染的方法，將合成的靶向特異性s i R N A 使用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0T r a n s f e c t i o nR e a g e n t 轉染L T E P —a 2 及A 5 4 9 肺腺癌細胞，干擾G a l e c t i n 一3 和P R L 一3蛋白的表達。3 、使用熒光定量R T —P C R 和W e s t e r nb l o t 方法在m R N A 水平

4、和蛋白表達水平檢測G a l e c t i n 一3 、P R L 一3 和R h o A 的表達情況。結果：1 、A 5 4 9 細胞中使用靶向特異性s i R N A 單獨阻斷G a l e c t i n - 3 的表達后，P R L 一3 、R h o A蛋白的表達顯著降低( P < O ．0 1 ) ，提示G a l e c t i n 一3 影響P R L - 3 、R h o A 兩種蛋白的表達，進而調節(jié)R h o

5、 A - G T P 信號途徑的激活，影響腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。2 、A 5 4 9 細胞使用s i R N A 單獨阻斷P R L 一3 后，R h o A 蛋白表達減少( P < 0 ．0 1 ) ，而G a l e c t i n - 3 的表達則無明顯影響，提示P R L 一3 對R h o A 蛋白的表達具有直接調節(jié)作用，推測G a l e c t i n 一3 可能是通過P R L 一3 間接調節(jié)R h o A —

6、G T P 磷酸化信號途徑的激活。肺腺癌細胞G a l e c t i n 一3 與P R L 一3 對R h o A —G T P 磷酸化信號途徑激活方式的研究 三T h e s t u d y o f R h o A - ·G T Ps i g n a l i n g p a t h w a y a c t i v a t i o nm a n n e r s b y G a l e c t i n - - 3a n d

7、P h o s p h a t a s e o f R e g e n e r a t i n go b j e c t i v e ：T ■ ^ ● 1 1 ‘ ?‘ L l v e r - 3 i nl u n 2 a n e n o c a r c i n o m a c e l li l n eA b s t r a c tT o i n v e s t i g a t et h e p o s s i b l em e c h

8、 a n i s m o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n G a l e c t i n - 3a n d P h o s p h a t a s e o fR e g e n e r a t i n g L i v e r - 3d u r i n ga c t i v i t i o no f R h o A - G T Ps i g n a l i n g p a t h w a y b

9、 y m o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e s ，a n a l y s i sa n dv m f y t h e s ep r o t e i n m o l e c u l e sb y f u n c t i o n a le x p e r i m e n t s i nl u n ga d e n o c a r c i n o m a c e l ll i n e

10、 ．O u r s t u d y w i l lc o n t r i b u t e t ob e t t e ru n d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l a rm e c h a n i s m s i n v o l v e di nl u n g a d e n o c a r c i n o m a a n d b e h e l p f u lt od e v e

11、l g p m e n t o f n e w a p p r o a c h e sf o r C a n C e rm o l e c u l a r t h e r a p y ．M e t h o d s ：1 ．G a B - o v e r e x p r e s s e dL T E P —a 2 l u n ga d e n o c a r c i n o m a c e l ll i n e s w a s c o n

12、 s t r u c t e d u s i n gG V 2 0 8 l e n t i v i r a lv e c t o rc o n t a i n i n g G a l e e t i n - 3m R N A e x o nf r a g m e n t ．2 ．1 i p i d - m e d i a t e d t r a n s f e c t i o nw i t hL i p o f e c t a m i

13、n e2 0 0 0 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t a n d t a r g e t i n gs p e c i f i cs i R N A w e r e u s e d t ot r a n s f e c tL T E P - a 2 a n d A 5 4 9 c e l ll i n e s ，e x p r e s s i o n o f G a l e c t i n 一

14、3 ，P R L - 3 a n d R h o A w e r e b l o c k e d r e s p e c t i v e l y i nt h e s ec e l l s ．3 ．T h ev a r y i n g m R N A l e v e l so f G a l e c t i n - 3 ，P R L - 3a n d R h o A w o r e a s s e s s e d b yo n e —s

15、 t e pR e a l - - t i m eQ u a n t i t a t i v e R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n ··P o l y m e r a s eC h a i n R e a c t i o n a n d f u r t h e r p r o t e i ne x p r e s s i o n l e v e l sw e r ea s

16、 s e s s e d b y W e s t e r n b l o t ．R e s u l t s ：1 ．W e s t e r n b l o ta n d R T - q P C R r e s u l t ss h o w e d t h a ta f t e r s p e c i f i c a l l yb l o c k i n g G a l e c t i n - 3 ，e x p r e s s i o n