半乳糖凝集素3的制備及果膠對(duì)其與T細(xì)胞相互作用的影響.pdf

1、半乳糖凝集素3（Galectin-3）是Galectin家族的重要成員之一，其分子量為30～35 kD，是唯一的嵌合型半乳糖凝集素。最新研究成果指出，Galectin-3作為一種腫瘤相關(guān)蛋白，與細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)作用，參與細(xì)胞黏附、增殖、凋亡、血管形成及mRNA剪切等活動(dòng)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。
　　 果膠是一類富含半乳糖醛酸的酸性雜多糖，在抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力方面有獨(dú)特的效果。研究表明，果膠

2、能夠通過與Galectin-3的作用，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞聚集和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤的作用。
　　 本文構(gòu)建了Galectin-3的表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化了Galectin-3蛋白提取純化的方法，建立了Galectin-3相關(guān)活性實(shí)驗(yàn)方法，研究了果膠對(duì)Galectin-3與T細(xì)胞相互作用的影響。具體內(nèi)容如下：
　　 成功構(gòu)建Galectin-3表達(dá)質(zhì)粒：利用克隆質(zhì)粒pOTB7-Gal-3，經(jīng)過PCR，獲得Galectin-3的編碼cDNA

3、，構(gòu)建帶有Galectin-3基因序列的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b（+）-Gal-3。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，表達(dá)質(zhì)粒含有Galectin-3基因片段，測(cè)序結(jié)果表明基因片段是Galectin-3基因。
　　 優(yōu)化Galectin-3蛋白表達(dá)條件：采用經(jīng)典的大腸桿菌表達(dá)蛋白的方法，優(yōu)化蛋白表達(dá)溫度和IPTG濃度兩個(gè)影響因素，分別進(jìn)行三個(gè)溫度和四個(gè)IPTG濃度的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示誘導(dǎo)溫度25℃，IPTG

4、濃度218.5μM為蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。
　　 提取純化Galectin-3蛋白：利用Galectin-3與asialofetuin結(jié)合的原理，將處理過的Fetuin（即asialofetuin）連接到Sepharose4B凝膠上，制備親和層析柱asialofetuin-sepharose4B。利用優(yōu)化的條件大量表達(dá)Galectin-3蛋白，經(jīng)親和層析柱純化，得到純化的Galectin-3蛋白。
　　 建立Galect

5、in-3相關(guān)活性實(shí)驗(yàn)方法：建立Galectin-3結(jié)合T細(xì)胞表面實(shí)驗(yàn)方法、Galectin-3誘導(dǎo)T細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)方法、Galectin-3誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法。
　　 檢測(cè)果膠對(duì)Galectin-3活性的影響：應(yīng)用上述活性實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)果膠類多糖Galactan、RGI-4、MCP對(duì)Galectin-3與T細(xì)胞相互作用的影響。結(jié)果顯示，Galactan對(duì)Galectin-3結(jié)合T細(xì)胞表面以及Galectin-3誘導(dǎo)的T細(xì)胞凝集