孤立性心房顫動(dòng)相關(guān)候選基因PITX2、NKX2-5、TBX5的遺傳學(xué)研究.pdf

1、背景：房顫是臨床最常見(jiàn)的心律失常，是導(dǎo)致腦卒中在內(nèi)的其他心血管并發(fā)癥的主要病因之一，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探索尚無(wú)定論。既往報(bào)道了多個(gè)基因和房顫的發(fā)病相關(guān)，如：KCNQ1，KCNE2，KCNJ2，KCNH2，GJA5，ANP 等。但由于房顫具有明顯的遺傳異質(zhì)性，不同患者可能具有不同的致病基因，因此有必要從孤立性房顫入手，研究房顫潛在的遺傳機(jī)制。目前人們認(rèn)為肺靜脈肌袖是引發(fā)和維持房顫的常見(jiàn)異位起源點(diǎn)。PITX2、NKX2-5 是和心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)

2、錄因子，同時(shí)也和肺靜脈肌袖發(fā)育相關(guān)。TBX5 作為一個(gè)和心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其突變導(dǎo)致心手綜合征。但有研究發(fā)現(xiàn)在一個(gè)心手綜合征家系中，TBX5 的突變多在伴有心手綜合征的房顫患者上發(fā)現(xiàn)。房顫群體關(guān)聯(lián)分析研究也提示TBX5 和房顫的發(fā)病相關(guān)。故PITX2、NKX2-5 和TBX5 基因作為房顫的候選基因，可能在房顫的發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用。
　　 目的：尋找PITX2、NKX2-5、TBX5 基因突變和房顫發(fā)病之間的關(guān)系

3、，并研究其具體作用機(jī)制，為房顫的基因治療提供更充分的證據(jù)。
　　 方法：收集187個(gè)孤立性房顫患者和200 名無(wú)血緣關(guān)系的正常對(duì)照者靜脈血，并提取血液DNA。以PITX2、NKX2-5、和TBX5 基因作為候選基因，采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析并對(duì)發(fā)現(xiàn)異常者直接進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)軟件對(duì)測(cè)序圖進(jìn)行分析。對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行保守性分析，并選擇保守性較好的突變R355C 通過(guò)定點(diǎn)突變方法構(gòu)建突變型TBX5R355C 質(zhì)粒，通過(guò)同源重組

4、策略構(gòu)建野生型TBX5WT 和突變型TBX5R355C 腺病毒感染大鼠心房肌細(xì)胞，檢測(cè)突變型TBX5R355C 是否調(diào)節(jié)其下游信號(hào)分子Cx40 和ANP 的表達(dá)，并檢測(cè)是否影響心房結(jié)構(gòu)蛋白MHCα，MLC2a，MLC2v；并通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)得到突變型TBX5R355C RNA 注射斑馬魚(yú)，觀察野生型TBX5WT 和突變型TBX5R355C 斑馬魚(yú)的表型，并通過(guò)多導(dǎo)電生理記錄儀采集斑馬魚(yú)的心電圖，觀察注射突變型TBX5R355C 的斑馬魚(yú)

5、是否有房顫等房性心律失常。
　　 結(jié)果：對(duì)于PITX2基因，在2 名房顫患者分別發(fā)現(xiàn)了位于內(nèi)含子區(qū)域的新改變g.766C>A 和位于5’UTR 區(qū)域的新改變g.8310C>T (c.-150C>T)；對(duì)于NKX2-5基因，在1 名合并有預(yù)激綜合癥A 型的陣發(fā)性房顫患者發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)第393位的C 堿基被T 堿基替代，從而導(dǎo)致氨基酸序列的131 位谷氨酸變成賴氨酸（E131K），該位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中普遍保守；對(duì)于TBX5 基因，在5個(gè)孤

6、立性房顫患者上發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)錯(cuò)義突變：c.1063C>T(p.R355C), c.1115C>T(p.S372L),c.1127A>G(p.Q376R), c.1283G>T(p.A428S),這4 個(gè)錯(cuò)義突變?cè)诓溉閯?dòng)物中保守性較好。200 名正常對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)上述堿基改變。感染了突變型TBX5R355C腺病毒的大鼠心房肌細(xì)胞，其Cx40和ANP蛋白表達(dá)明顯高于野生型TBX5WT，但心房結(jié)構(gòu)蛋白MHCα，MLC2a，MLC2v 的表達(dá)未受到

7、影響。而注射有突變型TBX5R355C RNA 的斑馬魚(yú)也顯示出心房顫動(dòng)的表型，其心電圖也記錄到心房顫動(dòng)或房速等房性心律失常的波形，并且斑馬魚(yú)的心臟結(jié)構(gòu)正常。
　　 結(jié)論：在中國(guó)孤立性房顫患者中發(fā)現(xiàn)影響肺靜脈肌袖發(fā)育基因PITX2的非編碼區(qū)改變、NKX2-5 的編碼區(qū)改變、及心臟發(fā)育相關(guān)基因TBX5 的編碼區(qū)突變。功能研究揭示心臟發(fā)育相關(guān)基因TBX5 的突變可不影響心臟結(jié)構(gòu)，并引起心臟電生理的異常，導(dǎo)致孤立性房顫。從而為我們進(jìn)一