乳鏈菌腫瘤特異性標(biāo)記系統(tǒng)及跨界thyA同源重組載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　腫瘤標(biāo)志物在臨床上已應(yīng)用了許多年，對(duì)腫瘤的早期診斷及后續(xù)療效觀察起了重要作用。但傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物特異性不高，在某些良性非腫瘤疾病也會(huì)引起假陽(yáng)性。此外，大部分腫瘤標(biāo)記物只局限于某一種或幾種特定組織類型的腫瘤而不能廣泛作用于不同組織類型的腫瘤。為了提高檢查準(zhǔn)確性及全面性，臨床上常將多種標(biāo)志物組成聯(lián)合標(biāo)志物組，對(duì)不同組織類型的腫瘤應(yīng)用不同的聯(lián)合標(biāo)志物組進(jìn)行檢測(cè)，作為篩查手段經(jīng)濟(jì)投入大，不符合成本-效益原則。
　　研

2、究發(fā)現(xiàn)PEG-3（progression elevated gene-3）是一種針對(duì)廣泛腫瘤特征的啟動(dòng)子，能特異性識(shí)別多種惡性腫瘤細(xì)胞，而不對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，具有很好的靶向性。國(guó)內(nèi)外關(guān)于PEG-3介導(dǎo)外源性基因表達(dá)的研究大多采用病毒載體。雖然能使基因高水平導(dǎo)入和表達(dá)，但所引發(fā)的宿主炎性免疫反應(yīng)較強(qiáng)，生產(chǎn)成本亦甚高，最重要的是病毒載體具有潛在危險(xiǎn)性。
　　研究表明,通過(guò)“菌感”的方法可安全有效地利用細(xì)菌介導(dǎo)外源性基因進(jìn)入細(xì)胞。即把

3、侵襲素（Inv）與溶血素（hly）基因結(jié)合,就能使不具備侵襲能力的細(xì)菌進(jìn)入非吞噬哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需之目的基因。這種“菌感”的方式已在大腸桿菌和金葡菌上進(jìn)行過(guò)試驗(yàn),乳鏈菌被認(rèn)為是一種對(duì)人體無(wú)害（generally regarded as safe, GRAS）的食品級(jí)的細(xì)菌，是作為“菌感”菌的最佳選擇。但傳統(tǒng)的乳鏈菌載體以紅霉素或氯霉素等抗性基因作為選擇標(biāo)志，存在使抗生素抗性播散的危險(xiǎn)。使用不帶有抗性標(biāo)記的thyA營(yíng)養(yǎng)缺陷型

4、細(xì)菌，具有更高的生物安全性。腸道有一定濃度的胸腺嘧啶核苷酸, thyA缺陷乳鏈菌能定植于腸道發(fā)揮作用。但thyA缺陷株不能在外界環(huán)境中生長(zhǎng)，從而避免了包括“菌感”基因、抗性基因在內(nèi)的外源基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。
　　如果我們將跨界重組thyA缺陷型乳鏈菌與腫瘤特異性標(biāo)記系統(tǒng)相結(jié)合，就能使“菌感”菌侵入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞表達(dá)和分泌綠色熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向標(biāo)記?？梢暬土炕[瘤細(xì)胞，不僅有助于檢測(cè)腫瘤，還可用于術(shù)前分級(jí)，術(shù)中

5、處理及術(shù)后監(jiān)測(cè)。此外，還為將來(lái)進(jìn)行基因靶向治療奠定基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　研究目的：
　　1.利用乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTRKH2構(gòu)建PEG-3啟動(dòng)子介導(dǎo)的腫瘤特異性標(biāo)記系統(tǒng)，并驗(yàn)證其腫瘤特異性標(biāo)記能力。
　　2.根據(jù)細(xì)菌thyA營(yíng)養(yǎng)缺陷型和雙交叉同源重組的原理，構(gòu)建一個(gè)含thyA基因的上、下游同源臂、inv基因及hly基因的同源重組質(zhì)粒。通過(guò)感染試驗(yàn)初步證實(shí)了其“菌感”能力，為下一步構(gòu)建thyA缺陷型跨界乳鏈菌腫瘤

6、特異性標(biāo)記系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　本研究的內(nèi)容主要分為兩部分：
　　一.腫瘤特異性標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建及其鑒定
　　方法：
　　我們采用體外基因拼裝（gene assembly）的方法得到PEG-3啟動(dòng)子，經(jīng)酶切鑒定得到陽(yáng)性克隆并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。然后利用基因克隆技術(shù)，將PEG-3啟動(dòng)子、egfp、poly A亞克隆到乳鏈菌-大腸桿菌穿梭載體pTRKH2的多克隆位點(diǎn)中，成功得到腫瘤特異標(biāo)記質(zhì)粒pTR-peg

7、3-egfp。最后，我們用pTR-peg3-egfp分別轉(zhuǎn)染腫瘤及非腫瘤細(xì)胞初步驗(yàn)證其腫瘤特異性標(biāo)記能力。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)PCR基因拼裝得到460bp左右腫瘤特異性啟動(dòng)子DNA序列，其測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致。獲得了腫瘤特異標(biāo)記的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTR-peg3-egfp，并在細(xì)胞水平得到初步驗(yàn)證。
　　結(jié)論：
　　PEG-3啟動(dòng)子介導(dǎo)的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒具有腫瘤特異性，為進(jìn)一步研究乳鏈菌疫苗應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記及靶

8、向治療奠定基礎(chǔ)。
　　二.跨界乳鏈菌同源重組載體的構(gòu)建及初步驗(yàn)證
　　方法：
　　通過(guò)in-fusion技術(shù)，將inv克隆至溫度依賴型乳鏈菌質(zhì)粒pVE6007中，得到pVE-inv質(zhì)粒，并送測(cè)序。將thyA-up、hly、thyA-down序列按所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)依次克隆入質(zhì)粒pVE-inv中，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pVE-inv-hly。長(zhǎng)出的單菌落先行PCR篩選出陽(yáng)性克隆，再經(jīng)酶切鑒定。分別用帶pVE-inv-hly質(zhì)粒的

9、乳鏈菌和帶pVE6007質(zhì)粒（不含inv、hly）的乳鏈菌對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2、肺癌細(xì)胞A549進(jìn)行感染試驗(yàn)初步驗(yàn)證其菌感能力。
　　結(jié)果：
　　測(cè)序表明，經(jīng)過(guò)in-fusion克隆的inv序列與目的序列一致。酶切鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建出約9600kb含thyA基因的上、下游同源序列、inv基因及hly基因的同源重組質(zhì)粒pVE-inv-hly。帶pVE-inv-hly質(zhì)粒的乳鏈菌進(jìn)行感染試驗(yàn)有菌落生長(zhǎng)，而帶pVE6007質(zhì)粒