乳鏈菌重組人bFGF表達(dá)載體構(gòu)建及初步驗(yàn)證.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸病（IBD）的一種，目前其發(fā)病機(jī)制之一是異常的自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，腸粘膜屏障的反復(fù)損傷，從而引起粘膜屏障功能缺陷。毒素和炎癥介質(zhì)引起局部的炎癥反應(yīng)，使黏膜屏障受破壞，有利于有害物質(zhì)的滲透，形成惡性循環(huán)。因此，目前臨床上治療UC的藥物如氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素等，都是通過抑制炎癥和免疫反應(yīng)，使癥狀得到緩解。
　　研究顯示，通過修復(fù)損傷腸上皮粘膜，加強(qiáng)腸道粘膜屏障功能，減少有害抗原和細(xì)菌的吸收，

2、炎癥反應(yīng)可被減輕、阻斷，從而起到治療疾病的目的。相關(guān)研究表明，bFGF能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞增殖，快速修復(fù)受損組織，改善結(jié)腸粘膜炎癥、減輕病損程度和病灶范圍。而且，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，bFGF在治療UC中起到積極的作用，將可能作為一種有希望的治療用藥。但 bFGF主要分布于腦垂體、神經(jīng)組織中，在其他組織中含量極少，遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際使用的需要。利用大腸桿菌表達(dá)的bFGF蛋白需經(jīng)過提純等多項(xiàng)步驟，生產(chǎn)成本較昂貴，蛋白在溶液中很不穩(wěn)定，

3、靜置后容易降解，極大地影響蛋白質(zhì)的活性。基于上述原因，bFGF蛋白在臨床應(yīng)用受到很大的限制。
　　我們利用食品安全級(jí)乳鏈菌，構(gòu)建pTR-bFGF表達(dá)載體，獲得重組乳鏈菌LL-bFGF，并對(duì)其分泌bFGF蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)，為后續(xù)潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建的LL-bFGF可通過直腸灌藥或口服的形式，使重組bFGF能直接在腸道內(nèi)高效、穩(wěn)定表達(dá)，免去提純、保存、運(yùn)輸方面的不便，降低生產(chǎn)成本。此表達(dá)系統(tǒng)不僅能加強(qiáng)腸粘膜屏障，而且有改

4、善腸道微生態(tài)平衡的作用。
　　目的:
　　本論文通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建含USP45信號(hào)肽的bFGF乳鏈菌表達(dá)載體pTR-bFGF，獲得高分泌表達(dá)的bFGF重組乳鏈菌LL-bFGF，并初步驗(yàn)證重組乳鏈菌分泌的bFGF功能。
　　方法:
　　1、以人bFGF為模板，對(duì)該基因序列進(jìn)行乳鏈菌密碼子優(yōu)化，使bFGF能在乳鏈菌中高效表達(dá)。
　　2、利用基因拼裝技術(shù)，將bFGF序列設(shè)計(jì)成18條具有19-25bp互相重疊長(zhǎng)

5、鏈引物，并在基因序列5’段加入乳鏈菌USP45信號(hào)肽，通過PCR擴(kuò)增合成bFGF，然后通過TA克隆至pMD20-T載體中，采用PCR及質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，最后基因測(cè)序驗(yàn)證。
　　3、通過PCR將終止子pePN連接至bFGF序列中，利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建Ptuf-USP45-bFGF-pePN全長(zhǎng)，并將其克隆至pbluescript載體中，經(jīng)驗(yàn)證正確后克隆至pTRKH2載體中，構(gòu)建乳鏈菌表達(dá)載體pTR-bFGF。
　　4、將pTR

6、-bFGF載體電轉(zhuǎn)化至乳鏈菌IL1403，構(gòu)建基因工程乳鏈菌LL-bFGF，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)其RNA表達(dá)，SDS-PAGE和Westernblot檢測(cè)bFGF蛋白表達(dá)，最后通過CCK-8檢測(cè)其蛋白活性。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建乳鏈菌表達(dá)載體pTR-bFGF，經(jīng)測(cè)序與目的序列相符。
　　2、通過電轉(zhuǎn)化獲得基因重組乳鏈菌LL-bFGF，SDS-PAGE和wb相應(yīng)位置可見條帶，CCK-8檢測(cè)顯示在bFGF上清液刺